Estudo comparativo do potencial anti-inflamatório e antioxidante da cianidina-3-glucósido e do ácido protocatecuico em células intestinais

Abstract

As Doenças Inflamatórias Intestinais (DII) são um grupo de doenças crónicas do trato gastrointestinal (GI) com elevada incidência a nível mundial. Estas doenças são caracterizadas por uma excessiva produção de mediadores pro-inflamatórios, excessiva ativação do fator de transcrição NF-κB e disfunção na barreira intestinal para além de, um aumento do stress oxidativo. Hoje em dia ainda não existe um tratamento específico para as DII e os fármacos usados para o tratamento estão associados a vários efeitos secundários. A falta de um tratamento e os efeitos secundários associados às terapias usadas criam a necessidade de investigar novas estratégias de tratamento mais eficazes e seguras. Os polifenóis, nomeadamente as antocianinas, são compostos abundantes na alimentação, e mostram possuir uma grande variedade de efeitos benéficos na saúde humana. Estes são conhecidos pela sua grande capacidade antioxidante e anti-inflamatória e, apesar da extensa biotransformação e baixa biodisponibilidade, as antocianinas mostram ser uma boa forma para tratamento e prevenção das DII. A cianidina-3-glucósido é uma antocianina descrita como um composto com grande capacidade antioxidante e anti-inflamatória, sendo metabolizada ao longo do trato gastrointestinal. O principal metabolito resultante dessa metabolização é o ácido protocatecuico. Este ácido fenólico, devido à presença de grupos hidroxilo ligados ao anel aromático, possui uma grande capacidade redutora de radicais, podendo estar envolvido nos efeitos benéficos da cianidina-3-glucósido. Este trabalho foi idealizado com o objetivo de realizar um estudo comparativo entre a cianidina-3-glucósido e o ácido protocatecuico relativamente aos efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios em células epiteliais do intestino, células HT-29, estimuladas com uma mistura de citocinas pro-inflamatórias, a IL-1α, o TNF-α e o IFN-γ. Inicialmente, num ensaio sem células, tanto o ácido protocatecuico como a cianidina-3-glucósido mostraram ser bons agentes redutores de radicais livres, possuindo uma atividade antioxidante superior à do Trolox. No entanto, em termos comparativos a cianidina-3-glucósido foi mais eficiente como composto antioxidante que o ácido protocatecuico.Relativamente aos ensaios em células, nem a cianidina-3-glucósido nem o ácido protocatecuico foram tóxicos para as células numa concentração até 25 μM, mas também não as protegeram da citotoxicidade induzida pela mistura de citocinas. A mistura de citocinas é capaz de desencadear a produção de diversos marcadores inflamatórios, nomeadamente, de óxido nítrico pelas células intestinais que foi, no entanto, fortemente contrariada quando as células foram pré-incubadas com a cianidina-3-glucósido 25 μM. Por outro lado, a pré-incubação com ácido protocatecuico 25 μM não conferiu uma proteção significativa. As citocinas induziram também uma alteração no estado redox das células, avaliado em termos de glutatião intracelular assim como de formação de espécies reativas de oxigénio. No primeiro caso, nem a cianidina-3-glucósido nem o ácido protocatecuico, 25 μM, contrariaram o efeito das citocinas, mas no segundo, conferiram alguma proteção, particularmente quando se avaliou a formação de espécies oxidantes por microscopia de fluorescência.

Inflammatory Bowel Diseases (IBD) are a group of chronic inflammatory diseases of the gastrointestinal tract with a high incidence worldwide. These diseases are characterized by an excessive production of pro-inflammatory mediators, excessive activation of the transcription factor NF-κB, dysfunction of intestinal barrier in addition to an increase in oxidative stress. Nowadays, there is still no specific treatment for IBD, and the drugs used are associated with various side effects. The lack of treatment and side effects associated to the therapies used creates the need to investigate new, safer and more effective therapeutic strategies. Polyphenols, including anthocyanins, are compounds largely available in the diet and they show a wide variety of beneficial effects on human health. These are known for its high antioxidant and anti-inflammatory activities and, despite the extensive biotransformation and low bioavailability, anthocyanins show to be a good strategy for the treatment and prevention of IBD. Cyanidin-3-glucoside is an anthocyanin with antioxidant and anti-inflammatory capacity, highly metabolized in the gastrointestinal tract being the protocatechuic acid the major metabolite formed. This phenolic acid, due to the presence of hydroxyl groups attached to the aromatic ring, possesses a great capacity to reduce radicals and may be involved on the health benefits observed by cyanidin-3-glucoside. This study was idealized with the aim to conduct a comparative study between cyanidin-3-glucoside and protocatechuic acid and its antioxidant and anti-inflammatory effects on intestinal epithelial cells, the cell line HT-29, stimulated with a pro-inflammatory cytokines mixture, IL-1α, TNF-α and IFN-γ. Initially, with a cell-free assay, both protocatechuic acid and cyanidin-3-glucoside have shown to be good free radical reducing agents, having a higher antioxidant activity then Trolox. However, in comparative terms, cyanidin-3-glucoside was more efficient as antioxidant then protocatechuic acid. In cell studies, neither cyanidin-3-glucoside nor protocatechuic acid were toxic in concentrations up to 25 μM, but failed to protect cells from cytokines-induced cytotoxicity.The mixture of proinflammatory cytokines also induced a significant increase in nitric oxide production by intestinal cells which was strongly counteracted when cells were pre-incubated with cyanidin-3-glucoside 25 μM. Cytokines also induced a change in the redox state of the cells evaluated in terms of intracellular glutathione as well as the formation of reactive oxygen species. Pre-incubation of the cells with cyanidin-3-glucoside or protocatechuic acid (25 μM) did not protect cells from glutathione depletion but have shown some protection against reactive oxygen species when assessed by fluorescence microscopy.