Mitochondrial signaling pathway in Alzheimer´s disease: disclosure of new therapeutic targets

Abstract

The etiology of sporadic Alzheimer´s disease remains largely unknown. Data from literature show that a bioenergetics failure, especially due to mitochondrial dysfunction, is a common event in Alzheimer’s disease and mild cognitive impairment, a clinical syndrome that frequently precedes symptomatic Alzheimer´s disease. Mitochondria play a pivotal role in cellular metabolism since they regulate key aspects of cellular metabolism by ATP production, also have important functions in intracellular calcium homeostasis, endogenous reactive oxygen species production and decide cellular fate by regulating programmed cell death. The use of cytoplasmic hybrid cell lines that contain mitochondria from Alzheimer´s disease and mild cognitive impairment subjects allow to infer that mitochondrial dysfunction, through complex IV decreased activity, are an upstream event in the pathology of Alzheimer´s disease. Further, the transfer of mitochondria from Alzheimer´s disease subjects, mild cognitive impairment and control subjects to mtDNA depleted cells enable to study downstream events driven by mitochondrial dysfunction. Previous studies using Alzheimer´s disease cybrids showed decreased complex IV, we extended these results by showing that in mild cognitive impairment cybrids complex IV dysfunction is also present. Besides decreased complex IV activity, Alzheimer´s disease and mild cognitive impairment cybrids also exhibit decreased mitochondrial membrane potential which favors the release of cytochrome c, an initiator of programmed cell death. Mitochondrial network is disrupted and more susceptible to stress in both groups. Also, oxidative stress markers are increased in Alzheimer´s disease cybrids while mild cognitive impairment cybrids did not reach the same damaged state. vii Since we have established that mitochondrial dysfunction is present in both groups of study we moved to evaluate its downstream effects. We found that mitochondrial respiration is decreased and mitochondrial oxidative phosphorylation is less coupled in Alzheimer´s disease and mild cognitive impairment cybrids. This drives a decrease in ATP/ADP ratio and activates a number of compensatory response pathways like AMPK. This is accompanied by a shift of Sirtuin1 from the nucleus to the cytosol and a decrease in its phosphorylation as well as a decrease in PGC1α levels. Nevertheless mitochondrial copy number as well as other markers for mitochondrial mass are increased. Our next goal was to access macroautophagy state in both goups. Macroautophagy is responsible for the degradation of protein aggregates and dysfunctional mitochondria, in a process called mitophagy. If this process is compromised in Alzheimer´s disease that may be explanation for the conflicting results on mitochondrial content stated above. Cytoplasmic hybrid cell lines were differentiated into neurons to have better understanding of the pathogenic processes on the brain. We found that mitochondrial network in Alzheimer´s disease and mild cognitive impairment groups is less interconnected and fragmented. This is in accordance with increased levels of proteins that orchestrate mitochondrial fission such as DRP1 and Fis1 and unchanged proteins responsible for mitochondria fusion, OPA1, MFN1 and 2. Further, the rise in the levels of Sirtuin2 in AD cybrids, a tubulin deacetylase that we found to be located only in the cytosol of differentiated cybrids, cause the breakdown of microtubules, which does not allow the completion of macroautophagic process since the transport of autophagosomes along microtubules to lysosomes is impeded in Alzheimer´s disease cybrids. Surprisingly, mild cognitive impairment cybrids are able to mount compensatory responses by increasing macroautophagy and microtubule stability. viii Because macroautophagy and, consequently mitophagy is impaired in Alzheimer´s disease, Abeta oligomers and other protein aggregates will accumulate and cause further toxicity. The exposure of Alzheimer´s disease cybrids to Sirtuin2 specific inhibitor AK1, prevented the loss of acetylated tubulin and consequently ameliorated macroautophagy process and the clearance of Abeta oligomers. In this thesis we show that mitochondrial dysfunction present in Alzheimer´s disease and mild cognitive impairment cybrids, triggers several pathways of the cellular metabolism including Sirtuin2 activation, which damages microtubules and compromises macroautophagy. We provide insights that mitochondrial regulation of microtubule-dependent cellular traffic compromises the degradation of aberrant protein aggregates and dysfunctional mitochondria. This innovate viewpoint of Alzheimer´s disease may pave the path for new therapeutic strategies targeting Sirtuin2, aiming to restore microtubule network proper function.

A etiologia da doença de Alzheimer permanece amplamente desconhecida. Várias evidências têm mostrado que a disfunção bioenergética, especialmente a disfunção mitocondrial, ocorre na doença de Alzheimer e em défice cognitivo ligeiro, uma síndrome que frequentemente precede a sintomatologia da doença de Alzheimer. As mitocôndrias têm um papel primordial no metabolismo celular pois regulam aspetos chave do metabolismo celular sendo responsáveis pela produção de ATP, têm funções importantes na homeostasia do cálcio intracelular, na produção de espécies reativas de oxigénio e decidem o destino celular regulando a morte celular programada. O uso de linhas celulares de híbridos citoplasmáticos, que contêm mitocôndrias de sujeitos portadores de doença de Alzheimer e défice cognitivo ligeiro, permite inferir que a disfunção mitocondrial, através do decréscimo da atividade do complexo IV é um evento precoce na patologia da doença de Alzheimer. Ademais a transferência de mitocôndrias de pacientes da doença de Alzheimer, defeito cognitivo ligeiro e controlos para células depletadas do seu ADN mitocondrial, permite o estudo de eventos devidos e posteriores à disfunção mitocondrial. Estudos já efetuados recorrendo aos cíbridos da doença de Alzheimer mostraram um decréscimo na atividade do completo IV. Nós mostramos que também os cíbridos de défice cognitivo ligeiro têm um compromisso na actividade do complexo IV. Para além desta alteração no complexo IV, os cíbridos da doença de Alzheimer e défice cognitivo ligeiro também exibem um decréscimo no potencial de membrana mitocondrial o que favorece a libertação de citocromo c, um iniciador da morte celular programada. A rede mitocondrial está interrompida e mais susceptível a stress em ambos os grupos. Os marcadores de stress oxidativo estão aumentados nos cíbridos da doença de Alzheimer enquanto os cíbridos de défice cognitivo ligeiro ainda não atingem o mesmo nível de dano. Como estabelecemos que a x disfunção mitocondrial está presente em ambos os grupos de estudo avaliamos os seus efeitos posteriores. Descobrimos que a respiração mitocondrial está decrescida e a fosforilação oxidativa mitocondrial está menos acoplada nos cíbridos da doença de Alzheimer e de défice cognitivo ligeiro. Tal conduz a um decréscimo no rácio ATP/ADP e ativa um número de respostas compensatórias como a via da AMPK. Tal é acompanhado por uma mudança na compartimentação da Sirtuina1 do núcleo para os citosol e uma diminuição da sua fosforilação tal como uma diminuição nos níveis de PGC1α. No entanto o número de cópias de DNA mitocondrial, tal como outros marcadores de massa mitocondrial estão aumentados. O nosso próximo objetivo foi determinar a via da macroautofagia em ambos os grupos. A macroautoafagia é responsável pela degradação de agregados proteicos e mitocôndrias disfuncionais, por um processo denominado mitofagia. Se este processo se encontrar comprometido na doença de Alzheimer então os resultados acima descritos sobre o aumento do conteúdo mitocondrial pode ser explicado. As linhas de híbridos citoplasmáticos foram diferenciadas em neurónios para obter um melhor entendimento dos processos patogénicos no cérebro. Descobrimos que a rede mitocondrial nos grupos de doença de Alzheimer e défice cognitivo ligeiro está menos interconectada e fragmentada. Esta observação está de acordo com os níveis elevados de proteínas que orquestram a fissão mitocondrial, tal como DRP1 e Fis1, e os níveis inalterados de proteínas responsáveis pela fusão mitocondrial, OPA1, MFN1 e 2. O aumento nos níveis proteicos da Sirtuina2, uma deacetilase da tubulina que encontrámos localizada apenas no citosol dos cíbridos diferenciados, causa o colapso dos microtúbulos o que não permite a completação do processo macroautofágico pois o transporte de autofagossomas, ao longo dos microtúbulos, está impedido nos cíbridos de doença de Alzheimer. Surpreendentemente os cíbridos de défice cognitivo ligeiro xi conseguem orquestrar respostas compensatórias aumentando a macroautofagia e a estabilidade dos microtúbulos. Devido ao comprometimento da macroautofagia e, consequentemente da mitofagia, os oligómeros de Abeta e outros agregados proteicos vão acumular agravando a toxicidade celular. A exposição dos cíbridos de Alzheimer a um inibidor específico da Sirtuina2, AK1, preveniu a perda de tubulina acetilada e, consequentemente melhorou o processo autofágico e a degradação dos oligómeros de Abeta. Nesta tese mostramos que a disfunção mitocondrial, amplamente presente nos cíbridos da doença de Alzheimer e défice cognitivo ligeiro, está envolvida em várias vias do metabolismo celular promovendo alterações do estado redox, activação da Sirtuina2 o que causa danos nos microtúbulos e compromete a macroautofagia. Nós mostramos que a regulação do tráfego dependente dos microtúbulos pela mitocôndria compromete a degradação de agregados proteicos aberrantes bem como mitocôndrias disfuncionais. Este inovador ponto de vista da doença de Alzheimer pode favorecer o aparecimento de novas estratégias terapêuticas visando a Sirtuina2, tendo como objetivo restaurar a função da rede microtubular.