Impact of methamphetamine on dentate gyrus neurogenesis: the underlying mechanisms and the role of neuropeptide Y

Abstract

A metanfetamina (MET) é uma droga de abuso, cujo consumo tem vindo a aumentar a nível mundial. Vários estudos mostraram que o consumo de MET induz danos irreversíveis a nível cerebral, reflectindo-se em défices cognitivos. Apesar dos mecanismos serem ainda pouco conhecidos, tem sido sugerido que a neurogénese do giro dentado (GD) poderá contribuir para estes défices, uma vez que tem um papel fundamental na cognição. No geral, a MET tem um impacto negativo na neurogénese do GD, nomeadamente na proliferação celular e na diferenciação em neurónios. Por outro lado, tem sido demonstrado que o neuropeptídeo Y (NPY) exibe propriedades protectoras, pró-proliferativas e pró-neurogénicas. Para melhor perceber os mecanismos implícitos nos défices cognitivos induzidos pela MET, o nosso objectivo consistiu em estudar o seu efeito na neurogénese do GD, focando principalmente na capacidade de auto-renovação das células estaminais, na diferenciação em neurónios e nas propriedades funcionais dos neurónios imaturos e maturos. Mais ainda, o papel protector do NPY foi avaliado na tentativa de identificarmos um potencial alvo terapêutico contra os efeitos nefastos provocados pela MET na neurogénese do GD. Neste trabalho, usámos neuroesferas do GD para estudar o impacto da MET nas propriedades de auto-renovação das células estaminais. Verificámos que a MET (1 nM) retarda a progressão do ciclo celular da fase G0/G1 para a fase S, aumentando o número de células na fase G0, acompanhado pela diminuição da expressão da ciclina E. Em paralelo, a MET diminuiu os níveis de fosforilação do receptor do factor de crescimento da epiderme (FGFR) e da proteína cinase regulada por sinal extracelular (ERK). Além disso, a MET (10 nM) diminuiu a capacidade de auto-renovação das células estaminais do GD verificado pela diminuição do número de neuroesferas. No entanto, a MET diminuiu a divisão celular no sentido da auto-renovação (pares de células Sox2+/Sox2+) aumentando no sentido da diferenciação (pares de células Sox2-/Sox2-), tendo sido este efeito mediado por receptores N-metil-D-aspartato (NMDA). Em concordância, verificámos que o fenótipo neuronal foi preferencialmente gerado. Em conclusão, a MET afectou negativamente a proliferação e a auto-renovação das células estaminais, mas levando à sua diferenciação em neurónios. No presente trabalho, foi também explorado o efeito da MET na morte celular, proliferação e diferenciação neuronal em culturas derivadas de neuroesferas do GD, bem como o papel protector do NPY. Estas culturas foram expostas a diferentes concentrações de MET (1 – 1000 nM) e foi verificado um aumento da morte celular por apoptose e por necrose para concentrações superiores a 10 nM sem, no entanto, afectar a proliferação celular. Mais ainda, a MET aumentou a libertação de glutamato, e a inibição dos receptores NMDA preveniu a morte celular por apoptose. Curiosamente, a MET diminuiu a diferenciação em neurónios para todas as concentrações testadas, inclusivamente a concentração não tóxica (1 nM). O NPY conseguiu prevenir a morte celular por apoptose induzida pela MET, através da activação dos receptores Y1 ou Y2, bem como o aumento da libertação de glutamato induzida pela MET. Por outro lado, o NPY preveniu também a diminuição do número de neurónios maturos provocada pela MET através da activação dos receptores Y1. É ainda de salientar que, por si só, o NPY promoveu a proliferação e a diferenciação neuronal através da activação dos receptores Y1. Em resumo, a MET teve um impacto negativo na viabilidade e neurogénese das células do GD, mas o NPY revelou-se uma ferramenta promissora contra estes feitos nefastos. O efeito da MET na neurogénese e nas propriedades funcionais dos neurónios imaturos e maturos foram avaliados num modelo animal de neurogénese no GD, os murganhos G42 (GAD67-GFP), em que os neurónios imaturos são identificados pela expressão da proteína verde fluorescente (GFP). Assim, os animais foram administrados com 2 mg/kg de MET, uma vez por dia durante 7 dias. A MET promoveu a diferenciação dos neurónios imaturos sem alterar o seu número. Contudo, a MET não teve qualquer efeito na cinética dos potenciais de acção (PAs) nem nas propriedades passivas de membrana (capacitância, resistência de membrana e potencial de membrana em repouso). As células GFP+ do grupo 2 e do grupo 3, que geram poucos PAs ou alta frequência de PAs, respectivamente, geraram correntes pós-sinápticas excitatórias (CPSEs), exibindo também potenciação após aplicação de trens de estimulação nas fibras do córtex entorrinal medial. Curiosamente, a MET induziu potenciação de longa duração (PLD) nas células do grupo 3, enquanto nas células maturas aumentou a amplitude da PLD. Em conclusão, a MET induziu diferenciação dos neurónios imaturos, incitou PLD nas células GFP+ do grupo 3 e gerou maior PLD nas células granulares maturas.

Methamphetamine (METH) is a drug of abuse, whose consumption has been increasing worldwide. Several studies reported that METH causes irreversible brain abnormalities that may reflect in cognitive deficits. Despite the fact that the underlying mechanisms are still not well known, it has been suggested that dentate gyrus (DG) neurogenesis may contribute to these deficits, since it plays an essential role in cognition. In general, METH exerts a negative impact in DG neurogenesis. In contrast, several studies evidenced that neuropeptide Y (NPY) displays neuroprotection and enhances proliferation and neurogenesis in the DG. Therefore, we aimed to study the effect of METH in DG neurogenesis, specifically looking to DG stem cell capacities, neuronal differentiation and functional properties of immature neurons. Furthermore, we unraveled if NPY could be a therapeutic target against the injurious effects caused by METH in DG neurogenesis. In the present work, we took advantage of DG neurosphere cultures to study the impact of METH on DG stem cell self-renewal functions. We observed that METH (1 nM) delayed cell cycle from G0/G1 to S phase transition, increasing the number of cells in the quiescent state (G0). In fact, these data correlated with a decrease in cyclin E expression. Also, METH decreased the phosphorylation levels of the epidermal growth factor receptors (EGFR) and extracellular-signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) protein levels. Moreover, METH (10 nM) decreased DG stem cell self-renewal as verified by the decrease in the number of secondary neurospheres. However, METH shifted DG cell division from self-renewal (Sox2+/Sox2+ pairs of daughter cells) to differentiation (Sox2-/Sox2- pairs of daughter cells), an effect mediated by N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor activation. In agreement, METH (10 nM) increased immature neurons in DG neurospheres. Overall, METH altered DG stem cell properties by delaying cell cycle and decreasing self-renewal capacities by shifting DG stem cell proliferation or self-renewal to differentiation towards neuronal fate. We also investigated the effect of METH on cell death, proliferation and differentiation in DG-derived neurosphere cultures, as well as the protective role of NPY. Cultures were exposed to different concentrations of METH (1 – 1000 nM) and an increase in cell death by necrosis and apoptosis was verified to concentrations up to 10 nM. Furthermore, METH (10 nM) increased glutamate release, and inhibition of NMDA receptors prevented cell death by apoptosis. Interestingly, METH decreased neuronal differentiation at all concentrations tested, including at the non-toxic concentration (1 nM). On the other hand, NPY prevented apoptotic cell death via activation of Y1 or Y2 receptor subtypes, as well as prevented glutamate release induced by METH. Again, the protective effect of NPY via Y1 receptors was verified as it prevented the decrease of mature neurons induced by METH. Besides, NPY by itself promoted cell proliferation and neuronal differentiation once again through activation of Y1 receptors. Taken together, METH negatively affects DG cell viability and neurogenesis, and NPY revealed to be a promising protective tool against the deleterious effects of METH on hippocampal neurogenesis. The effect of METH on the functional properties of new neurons was performed using an animal model of DG neurogenesis, the G42 (GAD67-GFP) mice, where immature neurons express the green fluorescent protein (GFP). Thus, mice were administered with 2 mg/kg METH (i.p.), once a day for 7 days. As a result, we found that METH promoted differentiation of GFP+ cells without changing their number. However, METH had no effect in action potential (AP) firing kinetics or in passive membrane properties (membrane capacitance, input resistance and resting membrane potential). Furthermore, GFP+ cells (group 2 and group 3, generating few or high frequency APs, respectively) generated excitatory postsynaptic currents (EPSCs) as well as potentiation upon medial perforant pathway (MPP) fiber stimulation. Interestingly, METH induced long-term potentiation (LTP) in group 3 cells, whereas generated a stronger LTP in mature DG neurons. In conclusion, METH leads to immature neurons differentiation, induces LTP in group 3 GFP+ cells and strengths LTP in mature DG neurons.