Interferência da inibição do proteossoma com a via Wnt no cancro do ovário

Abstract

O cancro do ovário representa o cancro ginecológico com maior taxa de mortalidade em Portugal. O mau prognóstico explica-se pelo estádio avançado em que a maioria dos tumores é diagnosticada. Os tratamentos atualmente à disposição são de eficácia limitada uma vez que induzem o desenvolvimento de resistência e o seu sucesso a longo prazo é questionável, com a maioria das pacientes a desenvolver recorrências. No sentido de ultrapassar estas barreiras, foram testados novos fármacos, como é o caso dos inibidores do proteossoma, um complexo enzimático que regula o proteoma celular por degradação de proteínas desnecessárias ou anómalas. Os inibidores dos proteossomas revelaram desde o início grande eficácia em tumores hematológicos, mas o mesmo não se verificou na generalidade dos cancros sólidos, como é o caso do cancro do ovário. Esta diferença não parece ser facilmente explicada, pelo que o conhecimento das vias que intercetam a função do proteossoma pode ajudar a desvendar os mecanismos envolvidos. Neste trabalho abordámos a via Wnt/-catenina, uma via de transdução de sinal particularmente envolvida no cancro do ovário, cujo funcionamento é influenciado pelo proteossoma. Especificamente, o proteossoma regula os níveis citoplasmáticos de -catenina, limitando a sua transmigração nuclear e consequente ativação dos genes alvo. Como modelo recorremos à linha celular de cancro do ovário TOV-112D; o inibidor do proteossoma usado foi o MG262. Estudou-se o tipo de morte celular por citometria de fluxo com dupla marcação para a Anexina IV e iodeto de propídeo; avaliou-se o grau de inibição do proteossoma por citometria de fluxo após marcação celular com anticorpo dirigido a proteínas conjugadas com ubiquitina; analisou-se a ativação da via NF-KB por citometria de fluxo após marcação com anticorpo específico para o NF-KB livre, ativo; avaliou-se a ativação da via Wnt/-catenina quer por imunofluorescência, quantificando a transmigração nuclear da -catenina, quer quantificando a expressão de um dos seus genes alvo, o gene da ciclina D1 (CCND1) por qRT-PCR; para avaliar a interferência da inibição do proteossoma com a agressividade tumoral, analisaram-se a expressão da subunidade catalítica da telomerase, hTERT e a expressão do gene SNAIL, associado ao fenótipo de transição epitélio-mesênquima, também por qRT-PCR, e a mobilidade celular, pelo teste wound-healing e teste de migração em câmaras transwell. Após 48 horas de exposição ao inibidor do proteossoma MG262, houve uma diminuição da viabilidade celular dependente da concentração (P < 0.05). O IC50 para este composto foi obtido para a concentração de 14 nM (R2=0.9945), uma concentração muito superior à registada para as doenças hematológicas. O tipo de morte celular preferencial foi a necrose e apoptose/tardia necrose. A inibição proteossoma ocorreu para a concentração de 5 nM (P < 0.05) e inesperadamente, verificou-se uma activação da via NFκB (P < 0.01) desencadeada por esta inibição. Por sua vez, verificou-se um aumento da expressão da β-catenina ao nível do núcleo (P < 0.01). Contudo houve diminuição da expressão do gene alvo CCND1 (P < 0.05), atribuída a uma sobreposição do efeito inibidor da viabilidade celular do MG262. Também a análise do gene hTERT refletiu a diminuição da proliferação celular (P < 0.05). Para o gene SNAIL não foram observadas variações significativas (P < 0.05). Ocorreu ainda uma diminuição estatisticamente significativa (P < 0.001) do potencial de migração celular por exposição ao MG262. Em suma, foi verificada uma tendência para diminuição da viabilidade celular com o aumento da concentração do inibidor do proteossoma MG262. Também se constatou uma diminuição de expressão de genes relacionados com a proliferação celular, além de diminuição de capacidade migratória das células. No entanto, a inibição do proteossoma promoveu a ativação da via NFκB e a transmigração nuclear da β-catenina, o que pode explicar as elevadas concentrações necessárias para obter perda de viabilidade celular, e o tipo de morte celular verificado. Conclui-se que os efeitos dos inibidores do proteossoma sobre as vias Wnt/ β-catenina e NF-KB poderão constituir uma possível justificação para o seu fraco desempenho no cancro do ovário.

Ovarian cancer is the most deathly gynaecological cancer. Its elevated mortality is related to the advanced state of the disease at which it is diagnosed. Nowadays treatments are characterized by development of resistance and comprise long-term inefficacy as most patients end up relapsing. In order to surpass these barriers, new drugs were tested, such as proteasome inhibitors, which regulate cellular proteome by degradation of misfolded or unnecessary proteins. Proteasome inhibitors have shown great results in treatment of haematological tumours. However, the same is not true for most solid tumours, such as ovarian cancer. This difference in response doesn’t seem easy explainable and more knowledge of proteasome function associated pathways might lead to an answer. The work here stated, focused on Wnt/β-catenin pathway, whose function comprises signal transduction. This pathway is closely related to ovarian cancer, being also influenced by the proteasome. Specifically, the proteasome regulates cytoplasmic levels of β-catenin and limits its nuclear transmigration and consequent activation of target genes. As model for this study, we used TOV-112D ovarian cancer cell line and the proteasome inhibitor MG262. It was investigated the type of cellular death by flux cytometry using double labels such as Anexin V and Propidium Iodide; it was also measured the extent of proteasome inhibition by flux citometry after cell labelling with an antibody directed against ubiqutin conjugated proteins; besides it was measured the activation of NF-κB by flux citometry after cell labelling with an antibody directed against free, active NF-κB. It was also accessed the activation of Wnt/β-catenin pathway, by immunofluorescence through quantification of β-catenin nuclear transmigration and by quantification of one of its target genes, cyclin D1 (encoded by CCND1) by qRT-PCR. The interference of proteasome inhibition with tumor aggressiveness was assessed by analysis of catalytic subunit of telomerase, hTERT and SNAIL gene expression, being the last one related to epithelial-mesenchimal transition fenotype. The expression of the mentioned genes was quantified by qRT-PCR. Cellular mobility was assessed by wound healing assay and migration assay in transwell chambers. After 48 hours of proteasome inhibitor MG262 treatment, it was observed a decrease in cell viability (P < 0.05), also it was established an IC50 of 14 nM for MG262 (R2=0.9945), which is clearly higher than for hematologic tumours. Necrosis and late apoptosis/necrosis were the most pronounced types of death. Inhibition of proteasome was accomplished at 5 nM (P < 0.05). Unexpectedly, it occurred an activation of NFκB pathway (P < 0.01) triggered by this inhibition. On the other hand, β-catenin was highly expressed in the nucleus (p < 0.01). Nevertheless, Wnt pathway target gene CCND1 expression suffered a decrease (P < 0.05) in agreement with cell death induction by MG262. Also, analysis of hTERT expression was diminished (P < 0.05), while SNAIL expression did not experienced alterations (P < 0.05). There was also a statistically significant (p < 0.001) decrease in migrating potential caused by MG262. In summary, cell viability was diminished in a MG262 concentration dependent fashion. It was also noted diminished expression of Wnt/β-catenin pathway target genes as well as cell proliferation and EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition) associated genes’ expression, in addition to reduction in migratory ability of TOV-112D. Nonetheless, proteasome inhibition promoted NFκB pathway activation and nuclear transmigration of β-catenin, which may explain the high doses necessary to reach loss of cell viability and the observed preponderant type of cellular death. In conclusion, the effects of proteasome inhibitors upon Wnt/β-catenin and NF-κB might constitute one possible explanation for the weak performance of proteasome inhibitors in ovarian cancer.