Synaptic localization of the amyloid precursor protein in the rat hippocampus

Abstract

Amyloid precursor protein (APP) is a transmembrane protein that is highly expressed in the brain. This protein is highly trafficked and processed in the neurons and its cleavage by β- and γ-secretases results in the production of β-amyloid, an important peptide in the pathophysiology of Alzheimer’s disease (AD). Although the real functions of APP are not known, many synaptic functions have been linked to it, such as synaptogenesis and regulation of pre-synaptic morphology. The synaptic presence of APP is not well defined, as is a possible differential distribution between different types of nerve terminals. The objectives of this study were to evaluate whether APP is enriched in synaptosomes, and if it is preferentially located in pre-synaptic, post-synaptic or extra-synaptic fractions of the synapse, as well as to determine if APP is differentially present in glutamatergic, GABAergic and cholinergic terminals in the rat hippocampus. Comparing the immunoreactivity of APP in synaptosomes and total membranes, we observed that this protein was not enriched in synaptosomes; however, it is present in significant amount in nerve terminals. Using a procedure of synaptic fractioning that allowed us to separate the pre-, post- and non-synaptic fractions, with a good degree of confidence, we observed that APP is principally localized in the pre-synaptic fraction, and that a small part of this protein was present in the post-synaptic fraction. These results are in accordance with the possible synaptic functions of APP and with the current knowledge of the traffic of this protein that is constitutively released in the synapse. Using immunocytochemistry in a preparation of purified nerve terminals (enriched in pre-synaptic fractions) from rat hippocampus, we observed that APP was more located in terminals positives for a glutamatergic marker, than in terminals positives for GABAergic or cholinergic markers. We evaluated if some X of the non-synaptic APP was present in astrocytes or in microglia, and did not find any evidences of its presence in these glial cells. Overall, this study shows that APP is present in hippocampal synapses, mainly in the pre-synaptic compartment. This could justify some of the synaptic functions of APP, and this “pool” of synaptic APP could also be involved in the production of β-amyloid peptide (Aβ) at the synapse. The accumulation of Aβ peptide at the synapses might contribute to the synaptotoxicity that occurs in early phases of AD, and is believed to contribute to the cognitive deficits associated with this neurodegenerative disorder.

A proteína precursora amilóide (APP) é uma proteína transmembranar bastante expressa no cérebro. Esta proteína é altamente processada e transportada nos neurónios e é clivada por β- e γ- secretases resultando na produção de β-amilóide, um péptido importante na patofisiologia da doença de Alzheimer (AD). Embora as verdadeiras funções da APP não estejam ainda esclarecidas, várias funções sinápticas têm sido atribuídas a esta proteína, como sinaptogénese e regulação da morfologia pré-sináptica. A presença sináptica da APP não está bem definida, e não é conhecido se a esta proteína está distribuída de maneira diferente entre os diversos tipos de terminais nervosos. Os objectivos deste estudo foram avaliar se a APP está enriquecida em sinaptossomas, se está preferencialmente localizada nas suas fracções pré-sinápticas, pós-sinápticas ou não sinápticas, e determinar se a APP está igualmente localizada em terminais glutamatérgicos, GABAérgicos e colinérgicos no hipocampo de rato. Comparando a imunorreactividade da APP em sinaptossomas e membranas totais, observamos que esta proteína não se encontra enriquecida em sinaptossomas; no entanto ela existe em quantidade considerável nos terminais nervosos. Usando um procedimento de fraccionamento sináptico que nos permite separar fracções pré-, pós- e extra- sinápticas com um bom grau de pureza, observámos que a APP está principalmente localizada na fracção pré-sináptica. Estes resultados estão de acordo com as possíveis funções sinápticas da APP e com o actual conhecimento do transporte desta proteína, que é constitutivamente libertada na sinapse. Através de técnicas de imunocitoquímca numa preparação de terminais nervosos purificados (enriquecidos em fracções pré-sinápticas) de hipocampo de rato, observámos que a APP está mais presente em terminais nervosos glutamatérgicos, do que em terminais GABAérgicos e colinérgicos. Avaliámos também se alguma parte do “pool” da APP XII não sináptica estava presente em astrócitos ou células de microglia, e não encontrámos evidências da presença desta proteína nestas células gliais. No geral, este estudo mostra que a APP está presente em sinapses de hipocampo, principalmente no compartimento pré-sináptico, o que pode justificar algumas das funções sinápticas da APP. Esta fracção sináptica de APP pode também estar envolvida na produção de péptido β-amilóide (Aβ) nas sinapses. A acumulação de péptido Aβ nas sinapses pode contribuir para a sinaptotoxicidade que ocorre nas fases iniciais da AD, e que se pensa contribuir para os défices cognitivos observados nesta doença neurodegenerativa