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Title: Avaliação do perfil de metilação em Síndrome Mielodisplásica – Estudo comparativo entre sangue periférico e medula óssea
Authors: Jorge, Joana Margarida Verdasca 
Orientador: Ribeiro, Ana Bela Sarmento
Veríssimo, Paula
Keywords: Síndrome Mielodisplásica; Metilação; Folato/vitaminaB12; Sangue periférico; Medula óssea
Issue Date: 2014
Abstract: A Síndrome Mielodisplásica (SMD) consiste num grupo heterogéneo de doenças clonais da célula estaminal hematopoiética essencialmente caracterizado por displasia morfológica, citopenias periféricas com medula hipercelular, e uma hematopoiese ineficaz resultado de um excesso de apoptose e uma anormal proliferação de blastos na medula óssea. Estes doentes apresentam uma elevada probabilidade de evolução para leucemia aguda, nomeadamente para Leucemia Mieloide Aguda (LMA). A alteração que desencadeia esta doença não é conhecida, mas pensa-se que terá origem numa célula estaminal hematopoiética com elevada suscetibilidade a alterações genéticas e/ou epigenéticas que induzem alterações na proliferação, diferenciação e sobrevivência, culminando na evolução do clone maligno. Os mecanismos envolvidos na patogénese de SMD são ainda, na sua maioria desconhecidos. No entanto, sabe-se que envolvem alterações em genes fundamentais no processo hematopoiético, que regulam a maturação e proliferação celular, o ciclo celular, a reparação do ADN e a apoptose. Um dos mecanismos fortemente associado à patogénese da SMD é a metilação do ADN, que demonstrou ser responsável pelo silenciamento de genes essenciais ao funcionamento celular normal, nomeadamente de genes supressores tumorais, que se sabe estarem transcricionalmente silenciados, em consequência da metilação das suas regiões promotoras. Os padrões de metilação aberrante são mecanismos extremamente comuns nas mais variadas neoplasia humanas, nomeadamente em doenças hematológicas, e sabe-se estarem associados ao início do desenvolvimento tumoral bem como na sua progressão. Os grupos metilos necessários ao processo de metilação podem ter origem em vias metabólicas que envolvem produtos da dieta, nomeadamente o folato e a vitamina B12. Estas vitaminas são elementos chave no metabolismo do carbono, responsável não só pela produção de moléculas necessárias para a síntese e reparação do ADN, mas também pela manutenção dos níveis de S-adenosilmetionina (SAM), o principal dador de grupos metilo endógeno na maioria das reações de metilação, incluído a metilação do ADN.A avaliação do perfil de metilação de ADN pode ser efetuada em diferentes tipos de amostras biológicas, nomeadamente em sangue periférico, medula óssea e tecido tumoral. A utilização de amostras de sangue periférico poderá constituir uma forma nãoinvasiva de análise de marcadores tumorais com elevado potencial clínico, nomeadamente na avaliação do tratamento com agentes hipometilantes. Apesar da avaliação do perfil de metilação em leucócitos do sangue periférico já ser utilizado como marcador tumoral em alguns tumores sólidos, como no cancro colorectal, o seu significado clínico em neoplasias hematológicas permanece desconhecido. Os objetivos deste trabalho foram avaliar o perfil de metilação de genes supressores tumorais e de recetores de morte em amostras de sangue periférico e de medula óssea de doentes com SMD, relacionando-os com os subtipos e com os grupos de risco. Além disso, avaliámos o envolvimento do folato e da vitamina B12 na metilação do ADN, correlacionando-os com os dados obtidos. Para tal, analisamos o perfil de metilação de genes supressores tumorais (p15, p16, p53, DAPK e MGMT) e de recetores de morte (TRAIL DcR1, TRAIL DcR2, TRAIL DR4 e TRAIL DR5) em ADN genómico de amostras de sangue periférico (SP) e de medula óssea (MO) de 82 doentes com SMD de novo, colhidas aquando do diagnóstico, e de 14 controlos não neoplásicos. A análise foi efetuada após a modificação do ADN genómico pelo método do bissulfito, utilizado a Polymerase Chain Reaction (PCR) especifica de metilação (MS-PCR). Os doentes apresentam uma mediana de idade de 76 anos (22-92), com um ratio Masculino/Feminino de 40/42. Os subtipos segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) são CRDU (n=10), ARSA/CRDM-SA (n=8), CRDU (n=41), AREB-1 (n=5), AREB-2 (n=9), SMD/NMP (n=8) e 5q- (n=1). De acordo com o International Prognostic Scoring System (IPSS) são: baixo (n=12), intermédio-1 (n=42) e intermédio-2 (n=9). Os nossos resultados indicam que 88,6% das amostras de SP e 61,5% das amostras de MO dos doentes com SMD apresentam metilação do gene p15, e que 22,7% das amostras de SP e 21,8% das de MO apresentam metilação do gene p16. O gene DAPK encontra-se metilado em 59,1% das amostras de SP e em 66% das amostras de MO. Os genes TRAIL DcR1 e TRAIL DcR2 apresentam metilação em 11,4% e 18,2% das amostras de SP, e em 8% e 16% das amostras de MO, respetivamente. O gene TRAIL DR4 apresenta-se metilado em 15,9% das amostras de SP e em 24% das de MO. X Por último, 29,5% das amostras de SP e 28% das amostras de MO apresentam metilação do gene TRAIL DR5. Nenhuma das amostras de doentes ou controlos apresentou metilação dos genes p53 e MGMT. De um modo geral, observa-se que 97,7% e 83,3% das amostras de SP e de MO dos doentes, respetivamente, apresentam metilação de pelo menos um gene, e 79,5% e 56,4% apresentam mais de dois genes metilados. Além disso, a metilação dos genes estudados apresentam percentagens elevadas de concordância entre amostras de SP e MO (p15: 72,5%, p16: 77,5%, DAPK: 67,5%, TRAIL DcR1: 85%, TRAIL DcR2: 65%, TRAIL DR4: 62,5%), à exceção do gene TRAIL DR5 (40%). No entanto, apenas os genes DAPK e TRAIL DR5 apresentam resultados significativos (p= 0,04 e p=0,031). Todos os subtipos de SMD apresentam metilação dos vários genes. A metilação do gene p16 encontra-se maioritariamente nos subtipos mais avançados (AREB-1 e AREB-2). Os genes p15 e DAPK encontram-se metilados em todos os subtipos, verificando-se tendência para diminuição muito ligeira com a severidade da doença. A metilação dos genes que codificam os recetores de morte é também comum a todos os subtipos, à exceção do gene TRAIL DR4 cuja metilação foi apenas observada em doentes dos subtipos menos agressivos (CDRU, ARSA e CRDM). Nos grupos do IPSS, verificamos haver metilação em todos os grupos de risco, no entanto, os grupos de risco baixo e intermédio parecem apresentar frequências de metilação ligeiramente superiores às do grupo intermédio-2. A metilação dos genes varia de acordo com os níveis de folato e de vitamina B12, sendo que, de uma forma geral, os doentes com concentrações séricas de folato e de vitamina B12 de altas a elevadas apresentam maiores frequências de metilação. No entanto, este padrão varia entre os vários genes, e com o tipo de amostra em que a metilação foi analisada. Os níveis de 5-metilcitosina (5-mC) são superiores em doentes com SMD (8,4 ± 4,9) (%) quando comparados aos controlos (1,4 ± 0,518). Os níveis de 5-mC variam com a concentração de folato, sendo que diminuem com o aumento da concentração do folato. No entanto, não se verificou uma relação direta entre os níveis de 5-mC e as concentrações de vitamina B12, uma vez que os níveis de 5mC não variam muito nos três grupos de doentes. Assim, concluímos que a metilação aberrante é um evento bastante comum nos doentes com Síndrome Mielodisplásica e pode estar relacionada com os subtipos da doença e com os grupos de risco do IPSS, confirmando o papel da metilação do ADN na patogénese desta doença. Os níveis séricos de folato e de vitamina B12 parecem estar relacionados com o perfil de metilação dos genes estudados, bem como com os níveis de 5-metilcitosina observados nos doentes com SMD. Além disso, existe uma correlação dos padrões de metilação dos vários genes entre as amostras de sangue periférico e as amostras de medula óssea dos doentes com SMD, sugerindo que o sangue periférico poderá eventualmente constituir um marcador periférico do status de metilação em doentes com SMD.
Myelodysplastic Syndromes (MDS) are a heterogeneous group of hematopoietic stem-cell disorders characterized by dysplastic features, peripheral-blood cytopenias with hypercellular bone marrow and ineffective hematopoiesis due to excessive apoptosis and abnormal blast proliferation in bone marrow. These patients have high risk of disease progression toward leukemic progression, mainly to Acute Myeloid Leukaemia (AML). The mechanism that triggers this disease is not known yet, but it probably originates from a hematopoietic stem-cell with high susceptibility to genetic and/or epigenetic changes that induce changes in cell proliferation, differentiation and survival that had an advantage growth to the malignant clone. The mechanisms involved in the pathogenesis of MDS are not completely understood, but they involve key genes in hematopoiesis, that control cell proliferation and maturation, cell cycle, DNA repair and apoptosis. DNA methylation is one of the epigenetics processes more frequently associated with MDS pathogenesis and several genes, namely tumor suppressor genes, have been shown to be transcriptionally silenced in association with promoter methylation. Aberrant methylation is extremely common in all types of cancers, as well as in hematopoietic disorders, and has been associated with cancer initiation and progression. The methyl groups necessary for methylation processes are derived from metabolic pathways that involves dietary products, mainly folate and vitamin B12. These vitamins are key elements in one-carbon metabolism which is responsible, not only for the production of molecules required for DNA synthesis and repair, but also for the maintenance of S-adenosylmethyonine (SAM) levels, the main methyl donor for DNA methylation. There are several types of specimens from which DNA methylation pattern can be measured and evaluated. Blood-based specimens may be a potential source of noninvasive cancer biomarkers, mainly for evaluation of hypomethylating agents treatment. Blood leukocytes from patients with solid tumors, namely colorectal cancer, exhibit complex and distinct cancer-associated DNA methylation patterns, which might XIII be seen as epigenetic biomarkers with significant clinical potential. However, peripheral blood cell methylation profiles are largely unknown in hematopoietic cancers. The aim of this work was to investigate the DNA methylation status of tumor suppressor genes (p15, p16, p53, DAPK and MGMT) and death receptors (TRAIL DcR1, TRAIL DcR2, TRAIL DR4 and TRAIL DR5) of 82 MDS de novo patients at diagnosis in bone marrow (BM) and peripheral blood (PB) cells, and of 14 nonneoplastic patients. Genomic DNA was isolated by standard protocols and modified using sodium bisulfite followed by a methylation specific PCR. The MDS patient group median age was 76 years (22-92), gender M/F=40/42, WHO subtypes: RCUD (n=10), RARS/RCMD-RS (n=8), RCMD (n=41), RAEB-1 (n=5), RAEB-2 (n=9), MDS/MNP (n=8) and 5q- (n=1) and IPSS: low (n=12), intermediate-1 (n=42) and intermediate-2 (n=9). Our results showed that 88,6% of PB samples and 61,5% of BM presented p15 gene methylated, 22,7% of PB and 21,8% of BM presented p16 gene methylated, 59,1% of PB and 66% of BM presented DAPK methylated, 11,4% of PB and 18,2% of BM presented TRAIL DcR1 methylated, 8% of PB and 16% of BM samples presented TRAIL DcR2 methylated, 15,9% of PB and 24% of BM samples presented TRAIL DR4 methylated and 29,5% of PB and 28% of BM samples presented TRAIL DR5 methylated. None of patients presented p53 and MGMT gene methylated. Overall, 97,7% of PB samples and 83,3% of BM samples from MDS patients presented at least one methylated gene, of these 79,5% of PB and 56,4% of BM samples presented two or more methylated genes. Moreover, we observed concordant results between BM and PB in 72,5% of patients for p15 gene, 77,5% for p16 gene, 67,5% for DAPK gene (p=0,04), 85% patients for TRAIL DcR1 gene, 65% for TRAIL DcR2 gene, 62,5% for TRAIL DR4 gene and in 40% patients for TRAIL DR5 (p=0,031). All MDS subtypes presented methylation in several genes. p16 gene methylation is observed mainly in more aggressive subtypes (RAEB-1 and RAEB-2). p15 and DAPK genes methylation was found in all disease subtypes, with a slight tendency to decrease with disease severity. Methylation of death receptors genes is common to all subtypes, except for TRAIL DR4 gene which was only observed in less aggressive subtypes, RCUD, XIV RARS and RCMD. All IPSS groups presented methylation of several gene promoters, but low and intermediate-1 risk groups presented higher methylation frequencies. Gene methylation varies with folate and vitamin B12 levels, patients with higher levels of folate and vitamin B12 presented higher methylation frequencies. But this pattern varies between genes, and changes in the two types of samples, peripheral blood and bone marrow. MDS patients also presented higher levels of 5-methylcytosine (8,4 ± 4,9) (%) compared with non-neoplastic patients (1,4 ± 0,518) but without any statistical significance. The 5-mC level varies with folate concentration, being reduced in patients with high levels of folate. There is no direct association between 5-mC level and vitamin B12, once this level don’t varies between the three groups of patients with different vitamin B12 concentrations. Our results show that aberrant methylation seems to be a common event in MDS patients and could be related with MDS subtypes and group risk, which suggests an important role of DNA methylation in MDS pathogenesis. Moreover, folate and vitamin B12 might be associated with DNA methylation status of the genes studied, as well as with 5-methylcytosine levels seen in MDS patients. We also observed a correlation between gene methylation patterns between peripheral blood and bone marrow aspirate suggesting that peripheral blood may possibly be a peripheral marker of methylation status in patients with MDS.
Description: Dissertação de mestrado em Bioquimica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
URI: http://hdl.handle.net/10316/25494
Rights: openAccess
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