Role of p66shc signaling on doxorubicin-induced cardiac mitochondrial dysfunction

Abstract

Doxorrubicina (DOX) é um composto antracíclico com propriedades anticancerígenas. Contudo, o uso deste composto é limitado devido a uma toxicidade cumulativa e dependente da dose que afecta o miocárdio e se manifesta como cardiomiopatia. A toxicidade induzida pela DOX é multifactorial e um dos principais mecanismos para explicar essa mesma toxicidade baseia-se no aumento de produção de espécies reactivas de oxigénio, que conduz à disfunção dos cardiomiócitos e apoptose. A proteína p66Shc tem sido descrita pelo seu papel ao ao nivel da resposta ao stresse em relação ao aumento dos níveis espécies reactivas de oxigénio. Quando ocorre um aumento do stresse oxidativo, a p66Shc é translocada para a mitocôndria contribuindo para aumentar ainda mais a produção de espécies reactivas de oxigénio e, consequente morte celular. No presente estudo, tivemos como objectivo investigar se a p66Shc é activada durante o tratamento com DOX da linha celular derivada de cardiomioblastos H9c2 de rato e, se o fator de transcrição FoxO3a, descrito por induzir a transcrição de genes envolvidos em apoptose e na paragem do ciclo celular, também está relacionado com a via redox que poderá estar a ser activada. Os nossos resultados demonstram uma activação da p66Shc após 24 horas de tratamento com DOX, apesar de contrariamente ao esperado, ter-se observado uma diminuição na razão entre a p66Shc fosforilada na serina 36 e a p66Shc total. Os nossos resultados também sugerem uma interacção entre a p66Shc e o FoxO3a, cuja translocaçao para o núcleo aumenta após tratamento com DOX, conduzindo à sobreexpressao de várias proteínas envolvidas na morte celular induzida pela DOX que incluem, a superóxido dismutase-2, p53 e Bim. Apesar de por si só provocar alguma citotoxicidade, o composto Hispidina, um inibidor da PKC β, foi usado no presente estudo de forma a bloquear a toxicidade induzida pela DOX nas células H9c2. Os resultados sugerem que a sinalização da p66Shc pode ter um papel na activação da resposta ao stresse/toxicidade induzida pela DOX após tratamento das H9c2 e a inibição selectiva desta via pode ser importante para a terapia, bem como base para investigar a persistência cardiotóxica induzida pela DOX, que é um efeito secundário característico desta antraciclina.

Doxorubicin (DOX) is a potent and broad-spectrum anthracycline with antineoplastic properties. However, the use of this drug is limited due to a dosedependent and cumulative myocardial toxicity that devolps to cardiomyopathy. DOXinduced cardiotoxicity is multifactorial, with increased reactive oxygen species production, which ultimately results in cardiomyocyte dysfunction and apoptosis, being hailed as one of the main mechanisms to justify DOX cardiotoxicity. p66Shc protein has been described for its role as a stress response for increased levels of reactive oxygen species (ROS). When oxidative stress increases, p66Shc is translocated to mitochondria promoting higher levels of ROS and causing cell death. In the present study, we aimed to investigate whether p66Shc signaling is activated during DOX treatment of the cardiomyoblast cell line H9c2 and whether the transcriptional factor FoxO3a, reported to transcriptionally activate target genes responsible for apoptosis and cell cycle arrest, is also involved in the activated redox pathway. Our results demonstrate that after 24h of incubation with DOX, there is an upregulation of p66Shc protein, although unexpectedly, a decreased ratio between the serine 36-phosphorylated form and total p66Shc was measured. Our results also suggest a physical involvement of p66Shc and FoxO3a that increases upon DOX treatment and FoxO3a translocation to the nucleus, leading to the up-regulation of several proteins involved in DOX cell death including superoxide dismutase-2, p53 and Bim. Hispidin, a PKC β inhibitor, was used in the present study to block DOX toxicity on H9c2 cells, although per se it caused already some cytotoxicity. The results suggest that p66Shc signaling may have a role in the activation of DOX stress/toxicity responses after H9c2 cell treatment and that selective inhibition of this pathway may be a promising therapeutic approach, as well as a good framework to investigate the persistent DOX cardiotoxicity, an hallmark of this anthracyclin.