Molecular Mechanisms Underlying in vitro Cerebral Ischemia: Multiple Neuronal Death Pathways

Abstract

Cerebral global ischemia induces selective neurodegeneration of specific subsets of neurons throughout the brain, namely in the CA1 region of the hippocampus. Despite its high prevalence and intensive research, there is still need of effective treatments to reduce the neurodegeneration associated with global ischemia. This pathology can be studied in vitro by depriving neurons of oxygen and glucose (OGD). Our main goal was to study the molecular mechanisms of neuronal death activated by OGD in primary cultures of hippocampal neurons. For this purpose we targeted distinct aspects of cell death. We studied the excitotoxic component of cell death mediated by NMDARs, we addressed the activation of a novel mechanism of programmed cell death, necroptosis, and we analyzed the activation of effector signaling cascades, in particular MAPKs. We started by studying the influence of the GluN2B subunit of NMDARs to OGD-induced neuronal demise. NMDARs are major contributors to the overload of intracellular Ca2+ characteristic of excitotoxicity and the role of GluN2 subunits has remained controversial. This is due to a variety of conflicting evidence showing that either both GluN2A and GluN2B contribute to neuronal death or that GluN2B is mostly pro-death and GluN2A pro-survival. To clarify this question we used cultured cortical neurons from GluN2B-/- mice and wild-type littermates, and observed that GluN2B is determinant for induction of excitotoxic neuronal death following OGD. We observed that the absence of this subunit blocked neuronal death induced by OGD and that the toxicity was rescued when we reintroduced the subunit in the KO neurons. Moreover, we demonstrated that the C-terminal domain (CTD) had a preponderant role in GluN2B-induced toxicity, and we identified molecular determinants in the CTD of GluN2B responsible for this function. We confirmed that the PDZ-binding domain was partly responsible for NMDAR toxicity. This domain is responsible for the interaction with PSD95 that couples to nNOS, and interfering with this interaction was neuroprotective. Additionally, we identified two other regions on the GluN2B CTD that are required for OGD-induced cell death, the AP2- and the CaMKII-binding domains. Mutations in either of these sites blocked GluN2B-mediated toxicity. These findings confirmed the crucial role of GluN2B-containing NMDARs in a context of in vitro ischemia, and our study is particularly relevant since most previous work was performed under excitotoxic conditions. Next, we investigated whether OGD induced necroptosis, a novel type of programmed necrosis, in hippocampal neurons. This type of cell death has been recently described to occur following death receptor (DR) signaling. In certain conditions a complex called DISC is formed. DISC induces apoptosis and downregulates necroptosis via caspase8-mediated cleavage of the proteins RIP1/RIP3. However, when caspase8 is inhibited, RIP3 is recruited to RIP1 and together they form a complex called the necrosome, and activate necroptosis. We observed that OGD induced a component of cell death that was reversed by the necroptotic inhibitor Nec-1 but not by zVAD.fmk, an apoptotic inhibitor. Notably, we observed that Nec-1 had no effect on the apoptotic component of neuronal death. Additionally, OGD induced the expression of RIP1 and RIP3. We confirmed the toxic role of RIP3 by performing overexpression and knock-down experiments. We observed that overexpression of both RIP1 and RIP3 exacerbated neuronal death induced by OGD whereas knockdown of RIP3 significantly reduced OGD-mediated toxicity. The damaging effect of the OGD challenge was rescued by reintroducing RIP3 in neurons where endogenous RIP3 was knocked-down, confirming the specificity of the requirement for RIP3. Finally, we correlated these in vitro events with the in vivo challenge, by confirming that global cerebral ischemia in the rat also induces RIP3 expression in the CA1 area of the hippocampus. Lastly, we studied the activation of MAPKs in hippocampal neurons submitted to OGD. These kinases are responsible for the majority of the cellular response to stress and are involved in several paradigms of cell death, including in neurons. We determined that both p38 and JNK are activated following OGD, at 2h and 6h of reoxygenation, respectively. Furthermore, inhibition of the activity of these MAPKs has a neuroprotective effect, suggesting a cytotoxic function. Interestingly, JNK seems to have biphasic function since neuroprotection was only achieved when we inhibited JNK at 4h reoxygenation. Overall, our results demonstrate that OGD induces a variety of changes in neurons, including several mechanisms that contribute to neurodegeneration. This in vitro model is thus a powerful tool to address the molecular mechanisms underlying cerebral ischemia, which may provide useful insights into the development of therapeutic strategies to this pathology.

A isquemia cerebral induz neurodegeneração de populações específicas de neurónios, nomeadamente na área CA1 do hipocampo. Apesar da sua elevada prevalência e dos esforços na investigação, não existem actualmente tratamentos eficazes para prevenir a neurodegeneração associada à isquemia global. Esta patologia pode ser estudada in vitro submetendo os neurónios a privação de oxigénio e glicose (OGD, do inglês “oxygen and glucose deprivation”). O principal objectivo deste trabalho foi o de estudar os mecanismos moleculares associados à morte neuronal iniciada pela OGD em culturas primárias de neurónios de hipocampo. Para este propósito pesquisámos diferentes aspectos da morte celular. Assim, estudámos o fenómeno de excitotoxicidade mediada por receptores de glutamato do tipo NMDA (NMDARs), analisámos a activação de um novo mecanismo de morte celular, necroptose, e verificámos a activação de vias efectoras da morte celular, em particular, as vias das MAPKs. Começámos por estudar a influência da subunidade GluN2B dos NMDARs na morte neuronal induzida por OGD. Os NMDARs têm um papel de relevo no excesso de Ca2+ intracelular característico da excitotoxicidade; contudo, o papel das subunidades GluN2 tem permanecido controverso. Há evidências que mostram o envolvimento das subunidades GluN2A e GluN2B no processo de morte celular enquanto outras mostram o papel tóxico do GluN2B e uma função neuroprotectora do GluN2A. Para clarificar esta questão recorremos a um sistema de cultura neuronal de murganhos GluN2B-/- e observámos um papel determinante da subunidade GluN2B na indução de morte após OGD em neurónios de córtex. Verificámos que a ausência do GluN2B eliminou a toxicidade induzida por OGD, que foi recuperada com a reintrodução da subunidade nos neurónios GluN2B-/-. Demonstrámos ainda o papel preponderante do domínio C-terminal (CTD) da subunidade na toxicidade mediada por GluN2B e mapeámos alguns locais de interacção no CTD de GluN2B responsáveis por esta função tóxica. O domínio PDZ é responsável pela interacção com a PSD95, que faz o acoplamento à nNOS. A interferência com esta interacção teve um efeito neuroprotector. Identificámos também dois determinantes moleculares no CTD de GluN2B relevantes para este processo, o local de ligação às proteínas AP2 e CaMKII. A mutação destes locais eliminou a toxicidade induzida pela subunidade GluN2B. Estas evidências apoiam o papel determinante dos NMDARs contendo GluN2B num contexto de isquemia cerebral in vitro. O nosso estudo é particularmente relevante na medida em que os trabalhos anteriores utilizavam, na sua maioria, estímulos excitotóxicos. De seguida, investigámos a indução de morte neuronal por necroptose, um novo mecanismo de necrose programada, em neurónios de hipocampo submetidos a OGD. Este tipo de morte celular ocorre na sequência da activação de “death receptors” (DRs). Em determinadas condições, ocorre a formação de um complexo que medeia a apoptose e inibe a necroptose através da clivagem das proteínas RIP1/3. Contudo, se ocorrer inibição da caspase8, a RIP3 é recrutada para a RIP1 e juntas formam um complexo chamado necrosoma, que activa a necroptose. A OGD induziu um componente de morte celular que foi revertido pelo inibidor de necroptose Nec-1, mas não pelo inibidor da apoptose zVAD.fmk. A especificidade do efeito protector da Nec-1 sobre a necroptose foi comprovada pela ausência de efeito da Nec- 1 no componente apoptótico. Além disso, a OGD induziu a expressão das proteínas RIP1 e RIP3. Confirmámos o papel tóxico da RIP3 através de ensaios de sobreexpressão e silenciamento. A sobreexpressão das proteínas RIP1 e RIP3 aumentou a morte neuronal, enquanto o silenciamento da RIP3 reduziu a toxicidade induzida por OGD. O efeito tóxico da OGD foi recuperado com a reintrodução da proteína RIP3 em neurónios sem RIP3 endógena. Por fim, relacionámos os mecanismos observados in vitro com o modelo in vivo, ao observarmos que a isquemia global induz o aumento da expressão da RIP3 na área CA1 do hipocampo. Estudámos por fim a activação de MAPKs em neurónios de hipocampo submetidos a OGD. Estas cinases são responsáveis pela resposta ao stress celular e estão envolvidas em diversos paradigmas de morte neuronal. Verificámos a activação das cinases p38 e JNK após OGD, às 2h e 6h de recuperação, respectivamente. Verificámos ainda que a inibição destas cinases teve um efeito protector, o que sugere um papel citotóxico. Curiosamente, a cinase JNK parece ter um duplo papel, já que a sua inibição só foi protectora quando efectuada às 4h após o estímulo de OGD. Concluindo, os nossos resultados demonstram que a OGD afecta os neurónios a vários níveis, incluindo na indução de mecanismos que contribuem para a neurodegeneração. Este modelo in vitro apresenta-se assim como uma ferramenta importante para a dissecção de mecanismos moleculares subjacentes à isquemia cerebral, o que poderá contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para esta patologia.