Neuronal changes under excitotoxic conditions: the role of 26S proteasome

Abstract

Os neurónios são um tipo celular altamente especializado e em condições fisiológicas normais a transmissão sináptica está envolvida em processos homeostáticos essenciais, nomeadamente em fenómenos de aprendizagem e memória. No entanto, durante um episódio isquémico os níveis de ATP decrescem para níveis abaixo do limiar necessário para os neurónios manterem os seus gradientes iónicos. Como resultado, o neurotransmissor glutamato é massivamente libertado e acumulado no espaço extracelular. O excessivo influxo de Ca2+ para a célula pós-sináptica devido à sobreactivação dos receptores do glutamato é responsável por iniciar diversas cascadas responsáveis por induzir morte celular. Em condições fisiológicas normais o sistema ubiquitina-proteossoma (UPS) é responsável pela reciclagem de numerosas proteínas, assim como pela degradação de proteínas danificadas. O UPS é o principal sistema de proteólise intracelular em células eucarióticas. Antes de as proteínas serem degradadas no UPS são primeiro marcadas com quatro (ou mais) ubiquitinas, por acção de ligases de ubiquitina (E3), sendo posteriormente enviadas para degradação no proteossoma 26S, um grande complexo dependente de energia composto por uma subunidade reguladora (19S) e por uma subunidade catalítica (20S). Tem sido demonstrado em diversos modelos de isquémia transiente global que o proteossoma 26S é desmontado nas suas subunidades constituintes, 19S e 20S, sugerindo o seu comprometimento após isquemia. Tendo em conta o papel desempenhado pela activação excessiva dos receptores do glutamato na morte neuronal na isquemia cerebral, neste trabalho foi estudado o efeito da excitotoxicidade na actividade do proteossoma em culturas de neurónios do hipocampo. Verificou-se uma redução transitória da actividade de quimiotripsina do RESUMO 2 proteossoma, em cerca de 50%, 4 h após uma breve estimulação com glutamato (125 μM, 20min), tendo-se observado uma redução da viabilidade celular nas mesmas condições experimentais. A inibição do proteossoma em neurónios do hipocampo submetidos a condições de excitotoxicidade foi confirmada usando um repórter de actividade do proteossoma UbG76V-GFP. Foi observada um aumento de cerca de 2.67 vezes na acumulação de UbG76V-GFP em neurónios expostos a condições de excitotoxicidade quando comparado com o controlo. Ao contrário do estímulo excitotóxico que reduziu a actividade do proteossoma e induziu morte celular num período de 4 h após a lesão, a incubação dos neurónios do hipocampo com o inibidor do proteossoma MG132 durante 5 h não teve qualquer efeito sobre a viabilidade celular. Só foi observada morte celular em resposta a incubações prolongadas (superiores a 8 h) com 0.05 μM e 1 μM do inibidor do proteossoma β-lactona. Estes resultados sugerem que a inibição do proteossoma não desempenha um papel relevante na morte neuronal em condições de excitotoxicidade. Neste trabalho estabelecemos ainda um protocolo para OGD em culturas de neurónios corticais. Foi observado um aumento da morte celular em cerca de 13,8% após um período de OGD de 2 h, seguido da incubação em meio de cultura condicionado, durante 12 h. Demonstrámos ainda a formação rápida de produtos de clivagem da proteína do citoesqueleto α-espectrina, com 145 e 150 kDa, 30min após o estímulo de OGD. A formação destes fragmentos sugere que as calpaínas são activadas rapidamente após a lesão isquémica in vitro. No conjunto, estes resultados sugerem que em condições excitotóxicas, características da isquemia cerebral por exemplo, ocorrem alterações bioquímicas que levam à desregulação do proteossoma e que, durante OGD há clivagem de proteínas do citoesqueleto que sugerem uma activação rápida das calpaínas. A prevenção de todas RESUMO 3 estas alterações bioquímicas pode ser encarada com uma potencial estratégia neuroprotectora que valerá a pena ser explorada.

Neurons are a very specialized cell type and proper synaptic transmission is involved in several important homeostatic mechanisms such as learning and memory. However, during an ischemic episode, ATP levels drop below the threshold required for normal cellular activity and ion gradients are dissipated. As a result, the neurotransmitter glutamate is massively released and accumulated in the extracellular space, and the excessive activation of glutamate receptors induces a Ca2+ overload into postsynaptic neurons which initiate cell death cascades. Under normal physiological conditions the ubiquitin-proteasome system (UPS) is responsible for the turn-over of proteins and for the degradation of damaged proteins. The UPS is the major proteolytic system in eukaryotic cells, and before degradation the substrate proteins are first tagged with four (or more) ubiquitin molecules by E3 ligases. Ubiquitinated proteins are then delivered to the 26S proteasome, a large energydependent entity consisting of a 20S catalytic core and a 19S regulatory particle, where they are degraded. The 26S proteasome was shown to be disassembled into the 20S and 19S particle in several models of brain ischemia, suggesting that is may be impaired. Given the role of excessive activation of glutamate receptors in neuronal death in brain ischemia, we investigated the effect of excitotoxicity on the proteasome activity in cultured hippocampal neurons. The chymotrypsin-like activity of the proteasome decreased by 50% when determined 4 h after excitotoxic stimulation with glutamate (125 μM glutamate; 20 min), and these results were correlated with a decrease in cell survival. Inhibition of the proteasome following excitotoxic stimulation with glutamate was confirmed by using the proteasome activity reporter UbG76-GFP, which showed an increased accumulation (2.67 fold) in hippocampal neurons exposed to glutamate when ABSTRACT 5 compared with the control. In contrast with the effect of excitotoxic stimulation which decreased proteasome activity and induced cell death within 4 h after the insult, incubation of hippocampal neurons with the proteasome inhibitor MG132 for 5 h did not affect cell viability. Proteasome inhibition with 0.05 and 1 μM β-lactone was induced hippocampal cell death only after incubation for more than 8 h. These results suggest that proteasome inhibition is not the major effector in excitotoxic neuronal death. We have also established a new OGD protocol to use in cultured cortical neurons. Exposure of cortical neurons to OGD for 2 h followed by incubation in culture conditioned medium for 12 h increased cell death by 13.8% when compared to the control. Cleavage of the cytoskeletal protein α-spectrin into its major 150 kDa and 145 kDa breakdown products was an early event after OGD, being observed at 30 min after the insult. The formation of these α-spectrin cleavage products suggests that calpains are rapidly activated under the experimental conditions used in this work. Taken together, the results suggest that excitotoxic glutamate application induces biochemical changes in the proteasome resulting in its downregulation, and OGD induces breakdown of cytoskeleton proteins prompting its disorganization. Preventing these biochemical changes can be a potential neuroprotective strategy to be exploited.