Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/20543
Title: Calpain-mediated proteolysis of ataxin-3 in Machado-Joseph disease
Authors: Simões, Ana Teresa 
Orientador: Almeida, Luís Pereira de
Duarte, Carlso Bandeira
Keywords: Doença de Machado-Joseph; Calpaína; Modelos animais
Issue Date: 27-Jul-2012
Citation: SIMÕES, Ana Teresa Antunes - Calpain-mediated proteolysis of ataxin-3 in Machado-Joseph disease. Coimbra : [s.n.], 2012. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/20543
Abstract: Machado-Joseph disease, also known as spinocerebellar ataxia type 3 (MJD/SCA3), is the most frequent autosomal dominantly-inherited ataxia worldwide. MJD is caused by a CAG expansion within the coding region of MJD1 gene mapped to chromosome 14q32.1, resulting the mutation in an abnormal polyglutamine tract at the C-terminal of the ataxin-3 protein. According to the toxic fragment hypothesis, MJD neurodegeneration might derive from the proteolysis of the mutant protein to liberate toxic fragments, which can then initiate the aggregation process associated with inclusion formation. Furthermore, a nuclear localization is predicted to be required for the manifestation of MJD symptoms. Understanding the cellular protease(s) responsible for the proteolytic mechanism and how ataxin-3 translocates from cytoplasm to nucleus could reveal potential targets for therapy. In this sense, we set out to investigate in animal mouse models whether and how are calpains involved in MJD pathogenesis. In chapter 1, a review of the importance of ataxin-3 proteolysis and nuclear localization in polyglutamine diseases, particularly the case of MJD, is presented. In chapter 2, we modulated calpain activity in a lentiviral mouse model of MJD by overexpression of calpastatin, an endogenous calpain-specific inhibitor, with adenoassociated viral vectors (AAV). We provide evidence that calpains are the proteases involved in mutant ataxin-3 proteolysis at amino acids 154, 220, 60 and 260 leading to the formation of putative fragments: a ~26 kDa fragment, C and N-terminal, and a ~34 kDa fragment, only C-terminal. Inhibition of calpains prevents the formation of both fragments, reducing the size and number of neuronal intranuclear inclusions of mutant ataxin-3, while mediating neuroprotection. Accordingly, upon three progressively increasing levels of calpastatin, we observed that the mean diameter of mutant ataxin-3 intranuclear inclusions was reduced, suggesting that, calpain-mediated proteolysis is required for ataxin-3 translocation to the nucleus and aggregation. Our results show that calpain overactivation and thus MJD progression could be propelled by depletion of calpastatin. In agreement, reduced levels of calpastatin were detected in MJD lentiviral and transgenic mouse models and, importantly, in MJD patients post mortem tissue. In chapter 3, a systemic strategy of calpain inhibition able to reach a broader distribution, while minimizing invasiveness was used. Our data show that an oral low molecular weight drug termed BDA-410 administered daily to a lentiviral mouse model is able to promote, by calpain inhibition, a decrease of mutant ataxin-3 fragments, fulllength and aggregate levels, an effect that does not result from reduction of mRNA expression. Preservation of DARPP-32 immunoreactivity, a regulator of dopamine receptor signalling, and reduced number of shrunken hyperchromatic nuclei are indicative of the neuroprotective effect provided by BDA-410. Our results also show that mutant ataxin-3 aggregates of specific size have different toxic properties. Accordingly, we found that larger aggregates colocalize significantly more with cleaved caspase-3 than smaller aggregates. BDA-410 calpain inhibition reduces the number of mutant ataxin-3 positive cells co-expressing cleaved caspase-3, contributing to a decrease in cytotoxicity. In chapter 4, a transgenic mouse model of MJD was used to evaluate calpain inhibitory effects after onset of neuropathology. Calpastatin overexpression through AAV vectors decreased mutant ataxin-3 full-length levels, stabilizing the fragments formation, and inhibited ataxin-3 translocation to the nucleus and consequent aggregation in the calpastatin-transduced area of seven months old transgenic mice. Moreover, in this chapter, to answer the question of what is the trigger of ataxin-3 proteolysis in MJD: calpains overactivation or calpastatin depletion, we analyzed noninjected transgenic mice at different ages. Our results show that ataxin-3 proteolysis increases with age. Nevertheless, the distinction of this event between wild-type and transgenic mice occurred at a younger age, being significantly increased in the latter mice, suggesting that proteolysis as a pathogenic mechanism is an early event. As calpastatin depletion in transgenic mice is age-dependent we can conclude that it is downstream to proteolysis. Unexpectedly, we could not prove that calpain inhibition can alleviate motor incoordination, probably due to a restricted calpain inhibitory effect in a specific region, which did not reach other affected brain regions, and due to a late calpain inhibition. In conclusion, this thesis provides evidence that calpains are the proteases involved in mutant ataxin-3 proteolysis and translocation to the nucleus. Furthermore, our results show that calpain inhibition either by viral transduction or oral administration mediates neuroprotection and might be considered an effective therapeutic strategy for MJD.
A doença de Machado-Joseph, também conhecida por ataxia espinocerebelosa tipo 3 (MJD/SCA3), é a ataxia autossómica dominante mais comum a nível mundial. A MJD é causada por uma expansão CAG na região codificante do gene MJD1 localizado no cromossoma 14q32.1, sendo a mutação traduzida numa cadeia de poliglutaminas anormal no terminal carboxílico da proteína ataxina-3. De acordo com a hipótese dos fragmentos tóxicos, a neurodegenerescência na MJD pode derivar da proteólise da proteína mutante conduzindo à formação de fragmentos tóxicos, que por sua vez iniciam o processo de agregação com formação de inclusões. Acresce que, para haver manifestação dos sintomas na MJD parece ser necessária a localização da ataxina-3 no núcleo. A compreensão do mecanismo proteolítico, em particular da(s) protease(s) celular(es) e dos fragmentos de clivagem da ataxina-3 e consequente transporte do citoplasma para o núcleo pode revelar potenciais alvos terapêuticos. Neste sentido, investigámos em modelos roedores animais se e como as calpaínas estão envolvidas na patogénese de MJD. No capítulo 1, é apresentado um resumo bibliográfico da importância da proteólise da ataxina-3 e sua localização nuclear nas doenças de poliglutaminas, em particular no caso da MJD. No capítulo 2, modulámos a actividade das calpaínas no modelo lentiviral murino da MJD sobreexpressando a calpastatina, o inibidor endógeno específico das calpaínas, através de vectores virais adeno-associados (AAV). Evidenciámos que as calpaínas são as proteases envolvidas na proteólise da ataxina-3 mutante nos aminoácidos 154, 220, 60 e 260 conduzindo à formação de fragmentos: um fragmento de ~26 kDa, C e N-terminal, e um fragmento de ~34 kDa, apenas C-terminal. A inibição das calpaínas previne a formação dos dois fragmentos, reduzindo o tamanho e o número de inclusões intranucleares da ataxina-3 mutante e promovendo neuroprotecção. Em conformidade, observámos que em três níveis crescentes de calpastatina, o diâmetro médio das inclusões intranucleares de ataxina-3 mutante decrescia, sugerindo que a proteólise mediada pelas calpaínas é determinante para o transporte da ataxina-3 para o núcleo e agregação. Os nossos resultados demonstram que a sobreactivação das calpaínas e por isso a progressão da MJD pode ser promovida pela deplecção da calpastatina. Na verdade, foram detectados níveis reduzidos de calpastatina nos modelos murinos lentiviral e transgénico e, mais importante, em tecido post mortem de doentes MJD. No capítulo 3, foi usada uma estratégia de inibição de calpaínas capaz de alcançar uma distribuição mais ampla minimizando o procedimento invasivo. Os nossos resultados demonstram que um fármaco de baixo peso molecular designado por BDA-410 administrado diariamente ao modelo lentiviral murino promove por inibição das calpaínas um decréscimo dos níveis de fragmentos, proteína não clivada e agregados de ataxina-3 mutante, efeito que não decorre dos níves de mRNA. A preservação da imunoreactividade da proteína DARPP-32, um regulador da sinalização dos receptores de dopamina, e uma redução do número de núcleos hipercromáticos condensados são indicativos de um efeito neuroprotector proporcionado pela administração do inibidor BDA-410. Os nossos resultados demonstram também que agregados de ataxina-3 mutante de diferente tamanho têm diferentes propriedades tóxicas. Neste sentido, verificámos que agregados maiores apresentam um aumento significativo na colocalização com a caspase-3 clivada. A inibição das calpaínas reduz o número de células imunoreactivas para ataxina-3 que co-expressam a caspase-3 clivada, contribuindo para o decréscimo de citotoxicidade. No capítulo 4, recorreu-se a um modelo de murganho transgénico de MJD para avaliar os efeitos inibidores das calpaínas após início da neuropatologia. A sobreexpressão da calpastatina por vectores AAV reduziu os níveis da ataxina-3 mutante não clivada, estabilizando a formação de fragmentos. Simultaneamente, a inibição das calpaínas em murganhos transgénicos de sete meses de idade inibiu o transporte da ataxina-3 para o núcleo e consequente agregação na área transduzida pela inibição das calpaínas. Neste capítulo, investigou-se ainda em murganhos transgénicos não tratados a origem do estímulo que desencadeia a proteólise da ataxina-3 na MJD: se a sobreactivação das calpaínas, se a deplecção da calpastatina. Os nossos resultados sugerem que a proteólise da ataxina-3 aumenta com a idade. No entanto, a distinção deste evento entre murganhos transgénicos e normais ocorre a uma idade inferior, estando aumentada nos murganhos transgénicos, o que sugere que a proteólise como mecanismo patogénico é um evento precoce. Como a deplecção de calpastatina é dependente da idade podemos concluir que ocorre posteriormente à proteólise. Inesperadamente, não conseguimos provar que a inibição das calpaínas pode prevenir a descoordenação motora, provavelmente por o efeito inibitório das calpaínas ter sido restrito ao estriado, não tendo incluído outras regiões afectadas do cérebro determinantes para o comprometimento da função motora, e possivelmente por a inibição das calpaínas ter sido efectuada tardiamente, tendo em conta que se observou que a sobreactivação da proteólise pela ataxina-3 mutante ocorre de forma precoce. Em resumo, esta tese demonstra que a proteólise da ataxina-3 mutante e o seu transporte para o núcleo é mediado pelas calpaínas. Para além disso, os nossos resultados demonstram que a inibição das calpaínas quer por transdução viral quer por administração oral promove neuroprotecção e pode ser considerada uma estratégia terapêutica eficaz para MJD.
Description: Tese de doutoramento em Farmácia, na especialidade de Biotecnologia Farmacêutica, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/20543
Rights: embargoedAccess
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