Please use this identifier to cite or link to this item: https://hdl.handle.net/10316/19542
Title: Early molecular events in the pathology of Machado-Joseph's disease or Spinocerebellar ataxia type 3
Authors: Tomé, Ricardo Jorge Ladeiro 
Orientador: Ribeiro, Sandra Macedo
Keywords: Doença de Machado-Joseph
Issue Date: 24-Apr-2012
Citation: TOMÉ, Ricardo Jorge Ladeiro - Early molecular events in the pathology of Machado-Joseph's disease or Spinocerebellar ataxia type 3 [em linha]. Coimbra : [s.n.], 2012. Disponível na WWW:<http://hdl.handle.net/10316/19542>. Tese de doutoramento
Abstract: Desde a descrição inicial da doença de Machado-Joseph (MJD) ou Ataxia espinocerebelosa tipo 3 (SCA3) muitos foram os avanços, tanto no acumular de conhecimento como na compreensão dos mecanismos inerentes à doença. O gene afectado no estado patológico é transcrito em múltiplas variantes de ARN mensageiro, diferindo entre si no splicing alternativo de exões, recentemente descritas como tendo uma distribuição heterogénea nos vários tipos celulares humanos. O padrão de expressão destes ARN foi recentemente descrito como favorecendo a expressão de pelo menos uma das variantes em células do sistema nervoso central, levando à produção de uma isoforma (considerada completa) de ataxina-3, possuindo três motivos de interacção com ubiquitina (UIMs), um domínio catalítico (Josephin) e uma região rica em poliglutaminas (polyQ), esta expandida no estado patologico. A função in vivo da ataxina-3 é ainda pouco conhecida, apesar de dados recentes apontarem para um papel na transferência de proteínas do retículo endoplasmático para degradação pelo proteosoma. O que é claro no entanto, e se tornou chave para a identificação histológica da doença, é a tendência da proteína expandida para se associar em agregados intracelulares, tipicamente nucleares, directamente relacionados com a morte celular patológica. Os parâmetros bioquímicos e biofísicos desta agregação são um tópico de interesse na literatura actual, não só no estudo desta patologia mas também no estudo de outras patologias hereditárias que partilham a alteração genética responsável pela expansão da região polyQ. Estas doenças são geralmente designadas poliglutaminopatias, com sintomas neurológicos relacionados com a auto-associação da proteína afectada. Curiosamente, tanto versões expandidas como não expandidas de proteínas contendo uma região polyQ co-localizam nos agregados intracelulares, sugerindo um ponto em comum no mecanismo molecular de agregação. No entanto, os padrões de neurodegeneração são específicos para cada poliglutaminopatia, sugerindo uma ligação entre a homeostase e o papel fisiológico da proteína afectada e justificando o estudo de cada proteína individualmente. Independentemente do mecanismo pelo qual a degeneração celular ocorre nestas patologias, a característica agregação de proteínas é regulada por parâmetros bioquímicos e biofísicos e tem lugar no início da progressão da doença. Uma esperança para uma futura aplicação terapêutica poderá estar na determinação destes parâmetros e no desenho de moléculas para prevenir ou reduzir a auto-associação. O trabalho desenvolvido por vários grupos tem fornecido vislumbres dos parâmetros de agregação da ataxina-3, particularmente de uma isoforma, dita completa, contendo dois UIM e recentemente descrita como menos estável em células. Juntamente com a expressão diferencial da isoforma com três UIM in vivo, torna-se claro que o foco de investigação na agregação da ataxina-3 deve ser reavaliado, estando uma caracterização extensa da isoforma até à data ausente da literatura. Para mais, a sugestão de que, para a ataxina-3 bem como para outras proteínas (nativas ou desenhadas), a região de polyQ não se encontra directamente envolvida nos passos iniciais de agregação, reforça a importância da determinação das interacções entre regiões e domínios da proteína em processos de agregação. O trabalho apresentado nesta tese almeja a caracterização detalhada da agregação da isoforma de ataxina-3 com três UIM, estabelecendo uma base para a comparação entre as isoformas ditas completas mencionadas acima, bem como para variantes truncados no terminal carboxílico, permitindo a avaliação da importância relativa dos domínios e regiões da proteína. Métodos de expressão e purificação de ataxina-3 são descritos, simultaneamente para proteína completa e variantes truncadas, e métodos de alta eficiência desenvolvidos para o estudo da agregação da proteína em condições fisiologicamente relevantes. A utilização destas ferramentas experimentais permitiu a determinação de parâmetros mecânicos e termodinâmicos da agregação de ataxina-3, levando à discussão do papel de cada região ou domínio da proteína no processo, bem como a apresentação de um modelo teórico para os passos iniciais de agregação de ataxina-3 em condições fisiologicamente relevantes.
From the original description of Machado-Joseph’s disease (MJD) or Spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3), much knowledge and understanding of the pathology of the disease has been accumulated. The affected gene in this disease is transcribed into multiple splice variants, recently found to be heterogeneously distributed across human cell types. Interestingly, the expression pattern of these transcripts has been shown to favour at least one of these variants in brain cells, coding specifically for a full-length protein with three ubiquitin interacting motifs (UIMs), a catalytic Josephin domain and a polyglutamine stretch (polyQ), the latter expanded in disease states. The in vivo function of the affected protein, ataxin-3, is not yet fully understood, though recent work has provided evidence for a role in shuttling ER proteins to the proteasome for degradation. What is clear, and has become the histological hallmark for the disease, is that the affected protein in the pathology, with its expanded polyQ stretch, shows a strong tendency towards self-association, typically accumulating in the nucleus of cells directly involved in pathological cell death. The biochemical and biophysical parameters of this self-association are a topic of growing interest, not just in the study of MJD/SCA3 pathology, but also in the study of other disease-related proteins found to share this genetic alteration, a polyQ expansion in the protein sequence. These diseases are generally referred to as “polyglutaminopathies”. Each of the proteins involved in these diseases is linked to protein self-association and leads to neurological disorders, typically of late onset. Somewhat surprisingly, there appears to be some cross-over of effects, as co-aggregation of pathological and non-pathological polyQ-containing proteins has been frequently observed, suggesting a common link. Nevertheless, the patterns of cell death (degeneration) in each polyglutaminopathy are specific, even if somewhat overlapping, indicating a direct link between homeostasis and the normal function of the affected protein, justifying the study of each protein in both pathological and non-pathological states. Regardless of the mechanism through which cell death occurs in these pathologies, the characteristic protein aggregation is ruled by biochemical and biophysical parameters and is at the start of disease progression. A hope for a future therapeutic approach lies in the determination of these parameters and the design of molecules to prevent or reduce this self-association. Work by several groups has provided insights into the aggregation parameters of ataxin-3, particularly a full-length isoform with two UIM, recently found to be less stable in cells. Together with the preferential expression of the three UIM isoform in vivo, it becomes clear that the research focus on ataxin-3 aggregation needs to be re-evaluated, as an extensive characterisation of this isoform’s aggregation is currently lacking in literature. Furthermore, the suggestion that, for ataxin-3 as well as other native proteins and engineered peptides the polyQ tract is not directly involved in the early steps of aggregation, strengthens the importance of determining the interplay between the protein’s regions and domains in the assembly process. The work presented in this thesis aims at characterizing the aggregation details of the 3UIM isoform of ataxin-3, establishing a basis for comparison between the full-length ataxin-3 isoforms mentioned. Furthermore, the relative influence of domains and regions of the protein in self-association, most of which are shared by the different isoforms found, is addressed. Specifically, methods for expression and purification of recombinant full-length and C-terminally truncated ataxin-3 protein are described, and high throughput methods for reproducible aggregation kinetics, under physiologically-relevant conditions, developed. With these experimental tools the mechanics and thermodynamical parameters of ataxin-3 aggregation were determined and the role of each region/domain assessed, allowing a model for the early aggregation events of ataxin-3 to be postulated.
Description: Tese de doutoramento em Bioquímica, na especialidade de Biologia Molecular, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: https://hdl.handle.net/10316/19542
Rights: openAccess
Appears in Collections:FCTUC Ciências da Vida - Teses de Doutoramento

Files in This Item:
File Description SizeFormat
Tese Ricardo Tomé.pdf19.76 MBAdobe PDFView/Open
Show full item record

Page view(s)

208
checked on Mar 26, 2024

Download(s)

18
checked on Mar 26, 2024

Google ScholarTM

Check


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.