Mitochondria and Cancer: Opening Pandora's Box

Abstract

Cancer is the Disease of the past decades but also will be the Disease of our future, due to the progressive increase in the numbers of cancer-related deaths. Associated with the still often imperfect methods of measuring incidence and precocious detection, many of the current therapeutics are not selective leading to several and harmful side effects. The best approach for cancer treatment passes through the reactivation of apoptotic pathways in tumor cells, sparing normal cells. Indirectly activation of apoptosis was shown not to be enough in many situations, since resistant cancer cells frequently have the capacity to neutralize the death signaling that converge into mitochondria, the powerhouses and often death executioners of cells. Therefore, mitochondria, due to their unique structural and functional features, appeared as a target of several compounds that are aimed to sensitize tumors to apoptotic death. With this objective, a group of compounds with specific structural features and activity was developed, the so-called mitocans. The overall goal of the present work is to characterize groups of mitocans that would lead cancer cells to death by opening mitochondria, which, not unlike Pandora’s Box, would open up and spread destruction into a desired target. The first step in the work led us to detect selected mitochondrial alterations in a panel of human breast cancer cells, comparing them to non-tumor cells. This is a critical step since it has already been described that tumor behavior is dependent on mitochondrial physiology, which can be modulated by alterations in oxidative phosphorylation and by mitochondrial DNA alterations. The next step in the work was the screening and characterization of the mechanism of action of possible mitocans phenolic acids, triterpenoids, berberine and sanguinarine. One of the strategies that is commonly used for anti-cancer drug delivery uses the fact that some cancer cells have a higher mitochondrial transmembrane potential (Δψm), the electrochemical gradient built across the inner membrane by the respiratory chain. In this context, some compounds used have positively-charged moieties, which is of the utmost importance for effectively targeting mitochondria, negatively charged in their inside. Also, the molecules used are phytochemical-based compounds. This class of compounds has been proposed as a promising and pragmatic clinical approach: besides reducing cancer risk, these molecules constitute a wide family of natural compounds with a considerable range of important properties such as safety, low toxicity, and general acceptance as dietary supplements. The biological activity of the novel compounds in different biological models, including cell lines in monolayer, and isolated mitochondrial fractions were evaluated. Cells were grown in glucose media or in glucose-free galactose/glutamine media, since in the later case energy is produced only by oxidative phosphorylation and hence direct mitochondrial toxicity is more easily detected. As for the first specific aim, we have characterized MCF-7 (adenocarcinoma; ER, PR and Herb2 positive), MDA-MB-231 (adenocarcinoma, ER, PR and Herb2 negative) and HS 578T (carcinosarcoma, ER, PR and Herb2 negative) breast cancer cell lines and compared primarily with non-tumor BJ fibroblasts. We have determined that differences between cells exist in what concerns to the Δψm, composition in proteins of the respiratory chain, intrinsic levels of pro- and anti-apoptotic proteins, among other differences. Also, the transition from a predominalty glycolytic to oxidative phosphorylation (OXPHOS) metabolism through manipulation of the media composition resulted in distinct alterations in cell behavior. Finally, the effects of classic mitochondrial poisons were different from cell to cell, demonstrating that distinct mitochondrial alterations may impact the way breast cancer cells react to mitocondrialdirected agents. As for the screening of possible new mitocans, we initiated the study by investigating derivatives of the phenolic acids caffeic and ferulic acids. We observed that the increase of lipophylicity of these derivatives increase their toxicity towards breast cancer cells, especially against the estrogen-positive MCF-7 cell line; however, these compounds do not seem to have direct mitochondrial effects. Contrarily, lupane triterpenoids derivatives were shown to have direct effects on mitochondria from breast cancer cells, resulting in inhibition of cell proliferation and arresting the cell cycle. As for the two benzophenanthrine alkaloids investigated, berberine possesses cytotoxicactivity against melanoma cells with several distinct mechanism, one of them being mitochondrial accumulation and toxicity at lower concentrations. Higher berberine concentrations accumulate in the nuclei and interfere with DNA synthesis. By its turn, sanguinarine cause apoptosis of melanoma cells at low micramolar concentrations, involving p53 activation. Despite the fact that sanguinarine was primarily accumulated in the nuclei, mitochondrial depolarization was observed in a sub-set of cells that suffered sanguinarine-induced nuclear DNA damage. Caspase 3 and 9 activation were also observed after sanguinarine addition. In conclusion, the present thesis proposes some molecules that act as a starting point for further refinement and development as anti-cancer agents, whose mechanism of action involves mitochondrially-mediated effects.

O Cancro é a Doença das decadas passadas mas também a Doenca das futuras, devido ao aumento progressivo de mortes associadas a esta doença. Os métodos de medição de incidência e detecção precoce são imperfeitos e estão de certa forma relacionados com a falta de selectividade das terapias, levando a efeitos secundários diversos e maléficos. A melhor forma de abordar o cancro é através da re-activação das vias apoptóticas nas células cancerígenas, no entanto não interferindo com as células normais. A activação indirecta da apoptose já foi demonstrada de não ser eficaz em várias situações, onde células cancerígenas resistentes demonstraram ter uma elevada capacidade de neutralizar os sinais de morte que convergem para a mitocôndria, fonte de energia e por vezes executora de morte das células. Portanto, com as suas características únicas estruturais e funcionais, as mitocôndrias aparecem como alvo preferencial de vários compostos para sensibilizar as células cancerígenas para morte. Tendo este objectivo em mente, grupos de compostos foram desenvolvidos com actividades e características estruturais especificas, os designados mitocans. O objectivo principal do presente trabalho é a caracterização de grupos de mitocans que poderão levar as células cancerígenas à morte através da abertura da mitocôndria, não diferente do efeito da Caixa de Pandora, num determinado alvo, abriria e espalharia a destruição. A primeira parte do trabalho levou-nos a detectar alterações mitocondriais num painel de linhas celulares de cancro da mama, comparando-as com células não-tumorais. Esta parte representa um momento importante, uma vez que já foi descrito que o comportamento tumoral está associado com a fisiologia mitocondrial, as quais podem ser moduladas por alterações na fosforilação oxidativa, bem como no DNA mitocondrial. O passo seguinte do presente trabalho foi testar e caracterizar os mecanismos de acção de possíveis mitocans ácidos fenólicos, triterpenoides, berberina e sanguinarina. Uma das estratégias usadas para a introdução de fármacos anti-cancerígenos nas mitocôndrias é o facto de alguns tipos de células tumorais apresentarem elevado potencial transmembranar mitocondrial (Δψm), gradiente electroquímico gerado através da membrana interna pela cadeia respiratória. Neste contexto, alguns dos compostos usados apresentam carga positiva, característica de extrema importância para alvejar a mitocôndria com eficiência, uma vez que esta encontra-se carregada negativamente no seu interior. Também, as moléculas usadas são baseadas em compostos fitoquímicos. Esta classe de compostos fora proposta como uma abordagem clinica pragmática e promissora: para além de reduzirem a incidência do cancro, estas moleculas constituem uma vasta família de compostos naturais, com consideráveis e importantes propriedades tais como segurança, baixa toxicidade, e como suplementos alimentares. A actividade biológica dos novos compostos foi avaliada nos diferentes modelos biológicos, incluindo linhas celulares em monocamada e fracções mitocondriais isoladas. Ainda, as células foram crescidas em meios contendo glucose ou contendo galactose e glutamina (sem glucose), estando no último caso o ATP a ser produzido maioritariamente pela fosforilação oxidativa e onde um efeito toxico directo ao nível mitocondrial será mais facilmente observavel. No contexto do primeiro objectivo especifico, caracterizamos as linhas celulares de cancro da mama MCF-7 (adenocarcinoma; ER, PR e Herb2 positiva), MDA-MB-231 (adenocarcinoma, ER, PR e Herb2 negativa) e HS 578T (carcinosarcoma, ER, PR e Herb2 negativa) comparando-as com fibroblastos BJ, não-tumorais. Os resultados mostraram que existem diferenças entre as linhas celulares estudadas no que respeita ao Δψm, composição de proteínas da cadeia respiratória, entre outras alteracoes. A transição de metabolismo predominantemente glicolítico para fosforilação oxidativa (OXPHOS) através da manipulação da composição do meio de cultura resultou em alterações significativas no comportamento cellular. Finalmente, os efeitos de perturbadores clássicos mitocondriais foram diferentes de célula para célula, verificando-se que alterações distintas mitocondriais poderão influenciar o modo como reagirão as células cancerígenas de mama a agentes directos mitocodriais. Na procura de possíveis mitocans, iniciámos o nosso estudo investigando derivados de ácidos fenólicos, nomeadamente dos ácidos cafeico e ferúlico. Observámos que com o aumento da lipofilicidade, os seus derivados aumentaram a sua toxicidade nas células cancerígenas de mama, especialmente nas células MCF-7 estrogéniopositivas; no entanto estes compostos não pareceram ter efeito direto na mitocôndria. Contrariamente, os derivados de lupanos triterpenoides demonstraram ter efeitos diretos nas mitocôndrias das células cancerígenas de mama, resultando na inibição da proliferação e bloqueio do ciclo celular. Quanto aos dois alcalóides da família das benzofenantrinas, a berberina possui uma actividade citotóxica nas células de melanoma através de diferentes mecanismos, sendo um deles de ser tóxica a baixas concentrações após de se acumular nas mitocôndrias. A elevadas concentrações, a berberina acumula-se no núcleo e interefere com a síntese de DNA. Por sua vez, a sanguinarina promove a apoptose das células de melanoma em concentrações na ordem dos micramolar, envolvendo a activação da p53. Apesar da sanguinarina ser acumulada primeiramente no núcleo, verificou-se despolarização mitocondrial num grupo de células que sofreram danos no DNA nuclear induzidos pela sanguinarina. Foram igualmente observadas a activação das caspases-3 e 9 após adição de sanguinarina. Concluindo, a presente tese propõe algumas moléculas que podem servir como modelos para futuros refinamentos e desenvolvimentos de agentes anti-cancerígenos, cujos mecanismos de acção envolvem efeitos directos na mitocôndria cardiaca.