Recombinant procardosin A : activation, kinetics and structure-function relationship

Abstract

As cardosinas são proteases aspárticas que se encontram em abundância nos pistilos de Cynara cardunculus L., sendo responsáveis pela actividade coagulante dos extractos de flor desta planta, usados tradicionalmente em Portugal no fabrico de queijo de elevada qualidade. Estas enzimas são sintetizadas na forma de precursores inactivos, contendo uma sequência sinal no seu terminal amínico, seguida de um peptídeo pró que precede a sequência da enzima madura. As cardosinas, como a maioria das proteases de plantas, possuem no interior da cadeia madura uma inserção com cerca de 100 aminoácidos conhecida como PSI (Plant Specific Insertion), que é removida durante a maturação. O domínio PSI possui homologia com a família das proteínas semelhantes à saposina (SAPLIP) e foi já demonstrado o seu envolvimento no endereçamento dos precursores das proteases aspárticas vegetais para o vacúolo; também foi proposto um papel do PSI no correcto enrolamento do precursor destas enzimas. Neste trabalho, a cardosina A foi expressa em E. coli sob a forma de corpos de inclusão e após a indução do enrolamento tridimensional, a proteína recombinante foi purificada por técnicas cromatográficas. Foi demonstrada a capacidade de autoactivação do precursor da cardosina A recombinante em ambiente acídico, originando uma enzima recombinante activa com parâmetros cinéticos e especificidades semelhantes à enzima nativa. Na segunda parte do trabalho, foi estudada a relação estrutura-função do domínio PSI da cardosina A. Este domínio possui capacidade de interagir e destabilizar vesículas fosfolipídicas, sendo essa capacidade dependente de pH acídico e da presença de fosfolípidos aniónicos. Neste trabalho foi demonstrada a importância dos aminoácidos básicos na manutenção da capacidade lítica do PSI. Foi também estudado o papel das pontes disulfeto para esta actividade do PSI, sendo descrito e caracterizado um duplo mutante de cisteínas com capacidade lítica significativamente aumentada.