Purificação e caracterização físico-química da protease de Cynara cardunculus L.

Abstract

A flor do cardo (Cynara cardunculus L.) é tradicionalmente utilizada em Portugal no fabrico de queijo. A protease responsável pela actividade coagulante foi isolada a partir de flores secas com um rendimento de 80%, por extracção dos estiletes com citrato de sódio 0,1M pH 3,0 seguida de cromatografia de exclusão molecular em Sephadex G-100 e liofilização. A protease migra em PAGE/SDS sob a forma de duas bandas distintas com massa molecular aparente 31000 e 16000 daltons. As duas bandas reagem positivamente à coloração com reagente de Schiff indicando que ambas são glicosiladas após desglicosilação com TFMS as subunidades migram em PAGE/SDS sob a forma de duas bandas com massa molecular de 27500 e 14400 daltons. As subunidades da protease de Cynara cardunculus L. foram isoladas por cromatografia de fase reversa em HPLC e por cromatografia de exclusão molecular em Sephadex G-100 na presença de guanidina 6M. A composição em aminoacidos e em hidratos de carbono, a análise do terminal aminico e os mapas petidicos com CNBr, tripsina e protease da estirpe V8 de S. aureus mostraram que a subunidade de 16000 daltons não é um fragmento proteolítico nem um monomero da subunidade de 31000 daltons. A protease é inibida por pepstatina e tem actividade proteolitica a pH acidico; tem o máximo de actividade a 50o C e é activa na presença de ureia, Triton X-100 e de alguns solventes organicos, sendo inibida por SDS e cloreto de guanidina. A protease de Cynara cardunculus L. tem preferencia por ligações peptidicas que envolvam aminoacidos hidrofóbicos clivando preferencialmente ligações do tipo (Phe, Leu, ILe)-(Val, Tyr). Tal como a maioria das restantes enzimas coagulantes a protease de C. cardunculus L. inicia a coagulação do leite por clivagem da ligação Phe105-Met 106 da K-caseína. A actuação desta protease na IgG humana resulta na formação de Fc e F(ab)2 respectivamente a parte efectora do anticorpo e a região que reconhece o antigénio.