Detecção electroquímica de óxido nítrico em fatias de hipocampo de rato com micoeléctrodos de fibra de carbono

Abstract

Na década de 80 o óxido nítrico (˙NO) foi identificado como o factor de relaxamento do endotélio (EDRF) e, desde então, tem havido um grande esforço no sentido de esclarecer a química, biologia e acções farmacológicas desta molécula. O ˙NO é um gás hidrofóbico de natureza radicalar e com curto tempo de vida, que se difunde rapidamente no meio celular. As características físico-químicas desta molécula permitem que seja considerado um mensageiro intercelular atípico, nomeadamente o facto de a informação que veicula estar associada à dinâmica de concentração no tempo e no espaço de um modo independente da interacção com receptores membranares específicos. O ˙NO é produzido por via enzimática pela enzima óxido nítrico sintase (NOS) cuja activação leva à conversão da L-arginina em óxido nítrico e L-citrulina e está envolvido numa miríade de processos fisiológicos que incluem, entre outros, a vasodilatação, o relaxamento muscular liso, a resposta imune, inibição da agregação plaquetar, estando também envolvido a nível cerebral em fenómenos de neurotransmissão e neurodegenerescência. Enquanto neuromodulador, o ˙NO possui propriedades muito especiais, uma vez que não é armazenado em vesículas e se difunde rapidamente através das células onde é produzido para as células vizinhas, actuando assim numa área localizada do sistema nervoso central. A nível neuronal, a produção de ˙NO ocorre via activação do receptor NMDA do glutamato, que inicia uma cascata de eventos intracelulares que modulam a plasticidade sináptica, o desenvolvimento, a aprendizagem e a memória de acordo com os modelos de potenciação e inibição de longo prazo. A activação excessiva destes receptores está na base do desenvolvimento de processos patológicos conducentes a fenómenos neurodegenerativos, como por exemplo a doença de Parkinson ou Alzheimer. Um dos principais problemas no estudo da actividade biológica do ˙NO é a determinação da sua concentração in vivo. A falta de dados quantitativos robustos levou à formulação simplista do dogma segundo o qual o ˙NO é uma toxina para elevadas concentrações e um modulador fisiológico para baixas concentrações. No entanto não se conhece com rigor a concentração de ˙NO nos tecidos e em particular no cérebro. Portanto, o desenvolvimento de metodologias analíticas para a medição do ˙NO in vivo é de uma grande relevância biológica e biomédica. A maioria das metodologias são indirectas, quantificando produtos de oxidação ou decomposição do ˙NO (e.g. espectrofotometria, colorimetria). As técnicas 4 Resumo electroquímicas permitem a medição directa em tempo real e com a utilização de microeléctrodos alia-se a resolução temporal a uma elevada resolução espacial. Este trabalho teve como objectivo principal o desenvolvimento e caracterização de microeléctrodos de fibra de carbono modificados quimicamente com Nafion® e orto-fenilenodiamina (o-PD). Depois da sua construção, procedeu-se a uma avaliação sistemática das suas características analíticas. Assim, o potencial de oxidação do ˙NO (+ 0,78 ± 0,02 V) foi determinado por voltametria de onda quadrada. Os microeléctrodos foram posteriormente calibrados por amperometria a + 0,9 V, obtendo-se um valor médio de sensibilidade de 954 ± 217 pA/μM ˙NO. Foram ainda caracterizados no que diz respeito ao limite de detecção (6 ± 2 nM ˙NO), tempo de resposta (t50% 1,9 ± 0,1 s) e selectividade contra potenciais interferentes com a sua detecção. Esta primeira parte do trabalho serviu de base para a realização de estudos posteriores que envolveram a medição em tempo real da dinâmica de produção e decaimento de ˙NO em fatias de hipocampo de rato. Neste âmbito, foram delineados três tipos de experiências: em primeiro lugar foi estimulada a produção de ˙NO através da activação do receptor NMDA do glutamato com diferentes estímulos, tendo sido calculada uma carga total média de 95 ± 8 nC, n=4 para os estímulos com 5 mM de L-glutamato e de 197 ± 38 nC, n=3 para os estíumulos com 10 μM de NMDA. De seguida, foi avaliada a intensidade da resposta em função da concentração de estímulo utilizada (800 ± 100 nM de DETA/NO para o estímulo de 10 μM de NMDA, 6,7 ± 2,0 μM de DETA/NO para o estímulo de 25 μM de NMDA e 13,0 ± 3,0 μM de DETA/NO para o estímulo de 50 μM de NMDA. O terceiro conjunto de experiências teve como objectivo a avaliação do perfil de resposta após estímulos consecutivos da mesma fatia de hipocampo (o primeiro estímulo produziu uma carga total de 41 nC enquanto que o segundo produziu uma carga total de 4,5 nC), ocorrendo um decaimento da intensidade do sinal de 80 ± 10% do primeiro para o segundo estímulo, em termos de carga total.