What HIF?: a new breath for cell dysfunction in diabetes

Abstract

Vascular dysfunction is a main feature of diabetes, contributing to the development of a variety of complications, such as retinopathy, nephropathy and cardiovascular diseases. Diabetes-related vascular complications can be caused by micro and macroangiopathy, display a significant inflammatory and oxidative stress component and are, to a large extent, associated with deregulation of cell and tissue response to ischemia. Cell proliferation under hypoxia is, primarily, regulated by the transcription factor hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). HIF-1 is a heterodimer that consists of a stable nuclear isoform HIF-1â and a cytosolic labile isoform HIF-1á. Under normoxia, two proline residues on HIF-1á (P402/P564) are hydroxylated. This leads to recruitment of the ubiquitin ligase von Hippel Lindau protein (pVHL), which induces HIF-1á polyubiquitination and its subsequent degradation by the proteasome. Under hypoxia, HIF-1á is neither hydroxylated nor degraded and accumulates in the nucleus, where it dimerizes with HIF-1â and activates the transcription of more than 70 genes involved in the cell response to hypoxia. Several data from the literature suggest that regulation of HIF-1á stability and activity may be impaired in diabetes and that hyperglycaemia is likely to be the leading cause of such deregulation. The molecular mechanisms associated with HIF-1á destabilization under high glucose remain elusive. However, in this work it was found that high glucose leads to increased production of methylglyoxal (MGO) by the cells and that increased levels of MGO are able to induce a rapid and dramatic proteasome-dependent degradation of HIF-1á, even under hypoxic conditions (chapter 4). Significantly, data indicates that this degradation does not require the recruitment of pVHL protein nor does it require hydroxylation of the proline residues P402/P564 on HIF-1á. More importantly, carboxy terminus of Hsp70-interacting protein (CHIP) was identified as the E3 ligase that ubiquitinates HIF-1á in the presence of MGO. Data shows that increased association of Hsp40/70 with HIF-1á induces CHIP recruitment, which promotes polyubiquitination and subsequent degradation of HIF-1á. Moreover, MGO-induced degradation of HIF-1á can be prevented by overexpression of glyoxalase I (GLO I), which is the rate-limiting enzyme of MGO catabolism and responsible for the MGO detoxification in cells. Consistently, MGO-induced destabilization of HIF-1á leads to a dramatic decrease both in HIF-1 transcriptional activity and expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), a target gene of HIF-1 that is crucial for the cellular adaptation to low oxygen levels. Recently, independent data further indicates that MGO can bind and modify the co-repressor mammalian Sin3 homolog A (mSin3A), leading to increased expression of angiopoietin-2 (Ang-2). Based on models of solid tumours, Ang-2 is known to provide a key destabilizing signal for vessels, leading to regression in the absence of pro-angiogenic factors, such as VEGF. Indeed, data of this thesis show that increased production of Ang-2 and decreased levels of VEGF, induced by MGO, lead to an imbalance on the VEGF/Ang-2 ratio secreted by retinal pigment epithelium cells. This imbalance was shown to induce apoptosis and decreased proliferation of retinal endothelial cells (chapter 5), which are cardinal features of diabetes and are likely to be responsible for the formation of acellular capillaries and microvascular abnormalities in diabetes. Increased modification of proteins by MGO is another main feature of diabetes. MGO is likely to account for impairment of the protein quality control, leading to accumulation of non-functional, potentially toxic proteins. However, the effect of MGO in the function of the ubiquitin-proteasome system and on molecular chaperones, involved in the protein quality control, remains elusive. In this work it is provided evidence that MGO may exert noxious effects in cells by impairing the ubiquitin-proteasome system, as well as the CHIP/ chaperones-mediated protein quality control axis. Consistently, this impairment is followed by the accumulation of obsolete proteins and cell injury, which are cardinal features of many diabetic complications. However, some of these MGO-induced changes appear to elicit a response from the heat shock factor-1 (Hsf-1) system and seem to be partially compensated by the activation of this transcription factor, which is a critical player in the cell adaptation and survival under stress conditions (chapter 6). In summary, this work highlights two different and new molecular mechanisms that help to elucidate and integrate in a common model two main features of diabetes: the loss of cell response to hypoxia and the accumulation of obsolete and toxic proteins in affected cells. Moreover, this work helps to envision new strategies for prevention and therapy of vascular diseases in diabetes, based on the delivery of genetic material through adenoviral vectors, for example to silence CHIP or overexpress GLO I.

A disfuncao vascular e uma das principais caracteristicas da diabetes, contribuindo para o desenvolvimento de uma variedade de complicacoes, como retinopatia, nefropatia e doencas cardiovasculares, e esta, em larga medida, associada a alteracoes na resposta celular e tecidular a situacoes de isquemia. A resposta celular face a situacoes de isquemia e regulada, principalmente, pelo factor de transcricao HIF-1 (hypoxia inducible factor-1). Este factor e um heterodimero composto por uma isoforma nuclear estavel, o HIF-1ƒÀ, e uma forma citosolica labil, o HIF-1ƒ¿. Em condicoes de normoxia, dois residuos de prolina presentes no HIF-1ƒ¿ (P402 e P564) sao hidroxilados, o que permite o seu reconhecimento por uma ligase de ubiquitina, designada por VHL (Von Hippel Lindau). Esta interaccao induz poliubiquitinacao do HIF-1ƒ¿ e subsequente degradacao pelo proteassoma. Em condicoes de hipoxia, o HIF-1ƒ¿ nao e hidroxilado e, como consequencia, nao e degradado, acumulando-se no nucleo, onde activa mais de 70 genes envolvidos na resposta celular a hipoxia. Alguns estudos recentes sugerem que os niveis elevados de glicose na diabetes comprometem a estabilidade e actividade do HIF-1ƒ¿. Os mecanismos moleculares associados a destabilizacao deste factor de transcricao, em condicoes de hiperglicemia, sao ainda desconhecidos. No entanto, este trabalho mostra que niveis elevados de glicose conduzem a um aumento da producao e acumulacao intracelular de metilglioxal (MGO) que, por sua vez, induz uma rapida degradacao do HIF-1ƒ¿, em condicoes de hipoxia. Os resultados obtidos mostram que essa degradacao nao envolve a hidroxilacao das prolinas P402/P564, nem o recrutamento da proteina VHL. Neste trabalho e identificada a CHIP (carboxy terminus of Hsp70-interacting protein) como sendo a ligase de ubiquitina envolvida no processo de degradacao do HIF-1ƒ¿ na presenca de MGO. Os resultados mostram que o MGO aumenta a interaccao do HIF-1ƒ¿ com os chaperones moleculares Hsp40/70, que por sua vez induzem recrutamento da CHIP, que poliubiquitina e promove degradacao do HIF-1ƒ¿ pelo proteassoma. Neste trabalho, demonstra-se ainda que a degradacao do HIF-1ƒ¿ e inibida pela sobreexpressao de glioxalase I (GLO I), a enzima envolvida na destoxificacao do MGO nas celulas. As implicacoes da degradacao do HIF-1ƒ¿ incluem uma diminuicao acentuada da actividade de transcricao do HIF-1 e da expressao de VEGF (vascular endothelial growth factor), um gene alvo do HIF-1 crucial na adaptacao celular e tecidular a condicoes de baixa pressao de O2. Dados independentes mostram que o MGO se pode ligar ao co-repressor mSin3A (mammalian Sin3 homolog A), levando a um aumento da expressao de Ang-2 (Angiopoietin-2). Alguns estudos envolvendo modelos de tumores solidos, demonstraram que a Ang-2 e um factor de crescimento que induz destabilizacao dos capilares e vasos sanguineos, levando a sua regressao na ausencia de factores pro-angiogenicos, como o VEGF. Tendo como base esses estudos, este trabalho mostra que o aumento da producao de Ang-2 e a diminuicao dos niveis de VEGF, ambas induzidas pelo MGO, levam a um desequilibrio da relacao VEGF/Ang-2 secretada pelas celulas do epitelio pigmentado da retina para o meio extracelular. Os resultados obtidos mostram que este desequilibrio induz apoptose e inibe a proliferacao de celulas endoteliais da retina, duas caracteristicas importantes das complicacoes vasculares da diabetes e que podem, pelo menos em parte, explicar a regressao vascular e as complicacoes microvasculares associadas a doenca. Uma outra caracteristica fisiopatologica da diabetes induzida pelo MGO e a modificacao de proteinas por processos de glicacao e oxidacao. Alguns estudos parecem indicar que o MGO pode comprometer os mecanismos de controlo de qualidade proteica, levando a acumulacao de proteinas obsoletas e, potencialmente, toxicas na celula. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos do MGO na via da ubiquitina-proteassoma e na estabilidade de chaperones moleculares, envolvidos no controlo de qualidade proteica, continuam ainda por esclarecer. Neste trabalho, mostra-se que o MGO compromete a actividade da via da ubiquitina-proteassoma e induz alteracao do eixo CHIP/chaperones moleculares, o que compromete o controlo de qualidade proteico. Essas alteracoes sao acompanhadas por uma acumulacao de proteinas modificadas e diminuicao da viabilidade celular, o que pode contribuir para o desenvolvimento de algumas alteracoes patologicas associadas a diabetes e que se caracterizam pela acumulacao de proteinas obsoletas e potencialmente toxicas para a celula. No entanto, o stress celular e algumas das alteracoes induzidas pelo MGO parecem ser parcialmente compensadas pela activacao do factor de transcricao Hsf-1 (heat-shock factor-1), crucial na resposta e sobrevivencia celular em situacoes de stress. Em resumo, este trabalho identifica dois novos mecanismos moleculares que podem contribuir para uma melhor compreensao de duas das principais caracteristicas fisiopatologicas da diabetes: a perda de resposta celular a hipoxia e a acumulacao de proteinas modificadas nas celulas. Este estudo cria, ainda, as condicoes para o desenvolvimento de novas estrategias de prevencao e terapia das complicacoes celulares associadas a diabetes, baseadas na entrega direccionada de material genetico, atraves de vectores adenovirais, para silenciamento da CHIP ou sobreexpressao da GLO I.