Linking open chromatin to pluripotency in ES cells : the role of the chromatin remodeler Chd1

Abstract

Embryonic Stem (ES) cells are the prototypical pluripotent stem cells that can self-renew indefinitely and give rise to all cell types of the body. Through a transcriptional profile using microarrays, we have discovered that the mouse embryonic germ line have high transcriptional similarities to pluripotent stem cells, including mouse ES cells. A group of about 220 genes are up-regulated in pluripotent stem cells when compared to differentiated cells. From this cluster (that we called the pluricluster) we decided to test the effect of down-regulation in ES cells self-renewal and pluripotency. We developed a lentiviral RNA-interference screen to test the role of 41 candidate genes (chosen amongst the pluricluster with a bias towards transcription factors, chromatin remodelers, DNA/RNA binding proteins, oncogenes and unknown genes). Our screen identified 18 genes with RNAi phenotype including Chd1, NFYa, NFYb and Sall4. The last three genes allowed me to follow further characterization of their role in ES cells and reprogramming, as a collaboration project. However, Chd1 was the only novel regulator that had both self-renewal defects and loss of Oct4 activity in this screen. Chd1 is a chromatin remodeler that has been shown to recognize H3K4me3 and is associated with transcriptional activation and splicing. Our work shows clear evidence that Chd1 correlates with H3K4me3 enrichment, which overlaps with RNA polymerase II localization. Downregulation of Chd1 using RNAi in mouse ES cells, leads to increased heterochromatin foci marked by H3K9me3 and HP1. Moreover, in the absence of Chd1, ES cells have self-renewal and pluripotency defects. Chd1-deficient cells are not able to form a typical endodermal layer upon embryoid body differentiation, and have high propensity for neural differentiation. Chd1 also plays a role in the generation of iPS cells by over-expression of the four factors Oct4, Sox2, N-Myc and Klf4. Down-regulation of Chd1 decreases the efficiency of the process, suggesting that Chd1 may be necessary for the chromatin reorganization during reprogramming to pluripotency. The role of Chd1 in ES cells suggests that pluripotent stem cells exist in a dynamic state of opposing influences between euchromatin and heterochromatin. In this thesis, I also suggest that indeed open chromatin may be necessary for ES cells to differentiate into all three germ layers, linking open chromatin to pluripotency.

As células estaminais embrionárias são a população típica de células pluripotentes, que têm uma capacidade infinita de auto-renovação e podem dar origem a todas as células do corpo. Através da análise global de expressão genética usando microarrays, descobrimos que células da linha germinal de ratinho são em grande parte semelhantes a células pluripotentes, incluindo células estaminais embrionárias de ratinho. Um conjunto de cerca de 220 genes estão sobre-expressos em células pluripotentes quando comparados com células diferenciadas. Neste conjunto de genes (a que chamámos pluricluster) decidimos testar o efeito da supressão de expressão na capacidade de auto-renovação e pluripotência das células estaminais. Desenvolvemos um ensaio de crivagem de supressão de 41 genes candidatos (em que foram escolhidos preferencialmente factores de transcrição, remodeladores da cromatina, oncogenes, moléculas de ligação a DNA e RNA, e genes com função desconhecida), usando RNA de intereferência através de uma infecção lentiviral. Desse ensaio identificámos 18 genes com fenótipo após a supressão de expressão, entre os quais os genes Chd1, NFYa, NFYb e Sall4. A função em células estaminais embrionárias e em reprogramação dos últimos três genes mencionados foi consequentemente caracterizada em projectos de colaboração. No entanto, o único novo regulador de células estaminais embrionárias que cujo fenótipo apresentava defeitos de auto-renovação e supressão de expressão do marcador Oct4 foi o gene Chd1. Chd1 é um remodelador da cromatina que reconhece a tri-metilação da lisina 4 da histona 3 (H3K4me3) e está associada a activação da transcrição e splicing. Aqui mostramos que Chd1 se liga a regiões do genoma enriquecidas ma marca H3K4me3 e também a RNA polimerase II. Supressão de Chd1 através de RNA de interferência em células estaminais embrionárias induz a formação de focus de heterocromatina marcados por H3K9me3 e HP1. Para além disso, as células perdem a capacidade de pluripotência e mostram defeitos na auto-renovação. Células Chd1-deficientes, após indução de diferenciação em corpos embrioides, não são capazes de formar a típica camada de endoderme, e têm uma alta propensão para neuro diferenciação. Chd1 tem também uma função na reprogramação de células diferenciadas em células pluripotentes induzidas (iPS) através dos factores Oct4, Sox2, Klf4 e N-Myc. Supressão da expressão de Chd1 reduz a eficiência do processo de reprogramação, o que sugere que Chd1 possa ser necessário para a reorganização da cromatina durante o processo de reprogramação. O papel de Chd1 em células estaminais embrionárias sugere que em células pluripotentes existe um estado dinâmico entre eucromatina e heterocromatina. Nesta tese, eu sugiro que de facto, uma cromatina aberta será necessária em células estaminais embrionárias para se diferenciarem em células de todas a linhas germinais, relacionando directamente uma cromatina aberta com pluripotência.