A utilização da rhEPO no doping : estudo dos efeitos cardiovasculares e metabólicos em ratos submetidos a exercício físico

Abstract

tenebrosa sombra do doping tem pairado e obscurecido, através da constante suspeição, o mundo do desporto, seus resultados e proezas. A eritropoietina (EPO), uma hormona natural produzida principalmente a nível renal, estimula (regula) a produção de eritrócitos que, pela cooperação da hemoglobina, transportam o oxigénio para os tecidos periféricos. Aumentar a entrega de oxigénio aos músculos é importante para optimizar a actividade muscular e melhorar a performance atlética, particularmente em modalidades de endurance, nas quais a componente aeróbia predomina. Segundo uma estimativa de 2002, o doping com rhEPO estava a ser praticado por 3-7% dos melhores atletas de endurance (Wilber, 2002). Um dos principais riscos do uso abusivo de rhEPO prende-se com o possível aumento da pressão arterial, o que, conjuntamente com a policitemia (aumento do número de glóbulos vermelhos) induzida, potencia a probabilidade de incidência de eventos cerebrovasculares ou de enfartes do miocárdio que se poderão correlacionar ao cada vez mais recorrente e consternante fenómeno de morte súbita com a prática desportiva. Neste contexto, neste estudo, pretendeu-se avaliar os efeitos bioquímicos, a nível cardiovascular e metabólico, resultantes da administração de rhEPO, enquanto doping em ratos Wistar sujeitos a protocolo de treino crónico (natação) e aeróbio de intensidade moderada. Para tal, idealizou-se um protocolo experimental com os seguintes grupos em estudo: grupo Controlo (Ctrl); grupo tratado com rhEPO (EPO); grupo exercício (Ex) e grupo exercício com administração concomitante de rhEPO (Ex+EPO). Foi estipulado um período experimental de 10 semanas, que se seguiu a um intervalo prévio de 3 semanas para adaptação à actividade física. No decorrer do trabalho, alargaram-se horizontes e estabeleceram-se novos protocolos. Assim, os objectivos específicos deste projecto foram os seguintes: 1º Estudo – Avaliar os efeitos da rhEPO no exercício crónico (treino) A – Efeitos da rhEPO por si só (grupo EPO versus grupo controlo) B – Efeitos da rhEPO em ratos submetidos a treino aeróbio crónico (natação) Para isso, consideraram-se os seguintes parâmetros: i - peso corporal; ii - pressão arterial, frequência cardíaca e trofismo tecidular; iii - parâmetros hematológicos: eritrocitários, plaquetares, reticulocitários e leucocitários; iv - concentração sérica de EPO; v - metabolismo do ferro, através das concentrações séricas de ferro, ferritina e transferrina; vi - parâmetros bioquímicos: glicemia, função renal e hepática, creatina cinase (CK) e perfil lipídico; vii - actividade do sistema nervoso simpático (SNS): através da concentração de catecolaminas em circulação (plasmáticas e plaquetares) e em tecidos periféricos (suprarrenais, rim, aorta, ventrículo esquerdo) e no cérebro; viii - actividade do sistema serotoninérgico: via concentração de 5-HT e 5-HIAA em circulação (plasmáticas e plaquetares) e no tecido neuronal; ix - marcadores de inflamação: pelas concentrações séricas de PCR, IL-2, IL-1β, TNF-α e TGF-β; x - indicadores do equilíbrio oxidativo: peroxidação lipídica (formação de MDA) no soro e no músculo, concentração sérica de 3-nitrotirosina (3-NT), capacidade antioxidante total (TAS) em soro e músculo, relação MDA/TAS; xi - estudo histomorfológico de tecidos. 2º Estudo – Efeitos da rhEPO em diferentes formas de exercício agudo (natação versus corrida): através da análise dos parâmetros anteriormente mencionados, acrescentando-se os dados relativos à duração da sessão extenuante. 3º Estudo – Efeitos da rhEPO no exercício (natação), crónico versus agudo: através dos grupos Ex e EPO+Ex da natação, dos estudos anteriores, elaborou-se este estudo comparativo crónico versus agudo. 4º Estudo – Variação da concentração sérica de EPO e do hemograma ao longo do tempo e em função da dose de rhEPO administrada: através do qual foram avaliados os efeitos da administração de rhEPO sobre os parâmetros hematológicos e bioquímicos, concentração de EPO e metabolismo do ferro. A administração de rhEPO, por si só, por um período de 10 semanas, na dose de 50 UI/kg/semana, promoveu aumento da pressão arterial, frequência e massa cardíaca, originou hiperlipidemia (sobretudo de LDL-c e TGs), provocou aumento do conteúdo plaquetar e neuronial de 5-HT, desencadeou, ainda, elevação dos marcadores inflamatórios (TNF-α e TGF-β), conferindo aumento do stresse oxidativo muscular, mas protecção antioxidante em circulação (aumento de TAS e redução de 3-NT). Os ratos submetidos a exercício físico continuado e tratamento com rhEPO (durante 10 semanas) obtiveram um aumento da concentração de GVs, da hemoglobina e do hematócrito, o que sugere um aumento da viscosidade sanguínea, acompanhado por hipertensão arterial, hiperactivação simpática e serotoninérgica, stresse oxidativo (sobretudo muscular) e inflamação, firmando um risco cardiovascular acrescido. A morte de um rato no grupo Ex+EPO (provavelmente devido a uma ocorrência cardíaca em função das modificações funcionais/estruturais verificadas), num universo de oito animais administrados com rhEPO (50 UI/kg/sem), estabelece uma probabilidade superior a 10%, o que constitui um sinal expressivo sobre os perigos de vida associados à prática de doping continuado com rhEPO em atletas. A prova aguda desencadeou efeitos distintos consoante a modalidade: a corrida proporcionou, essencialmente, reduções benéficas do perfil lípidico (Total-c e LDL-c) e aumentos danosos dos marcadores pró-oxidantes, enquanto a natação favoreceu maior activação do SNS. A administração prévia de rhEPO (durante 3 semanas) resultou em: no exercício físico agudo, maior resistência física, hiperglicemia, melhoria do perfil lipídico e protecção ampliada contra o stresse oxidativo. Na natação, em particular, a rhEPO exacerbou a activação do sistema nervoso simpático e serotoninérgico. A comparação entre o treino crónico e o exercício agudo, nos grupos administrados com rhEPO, permitiu demonstrar um efeito muito mais nefasto em ratos submetidos a exercício crónico. Com efeito, verificou-se um aumento da concentração de GVs, da hemoglobina e do hematócrito, sugerindo um aumento da viscosidade sanguínea que, conjuntamente com o desenvolvimento de hipertensão arterial, hiperactivação simpática e serotoninérgica, stresse oxidativo e inflamação, enfatizou o risco cardiovascular. Por outro lado, o efeito da rhEPO no exercício agudo manifestouse, principalmente, por propiciar activação plaquetar, aumento da glicemia e enérgica activação serotoninérgica, sem fornecer modificações de relevo ao nível do SNS e inflamação, fomentando mesmo uma melhoria do perfil oxidativo. Conclui-se que os atletas em treino regular e doping concomitante com rhEPO se encontram altamente sujeitos às complicações cardiometabólicas resultantes da utilização ilegal desta substância e apresentam um elevado risco de sofrer episódios do

The terrible shadow of doping has been storming and darkening, through the constant suspicion, the world of the sport, it´s accomplishments and remarkable achievements. Erythropoietin, a natural hormone produced mainly in the kidneys, stimulates (and regulates) the production of red blood cells, which, in association with hemoglobin, carry the oxygen to the peripheral tissues. Increasing the delivery of oxygen to muscles is important to optimize the muscular activity and improve the athletic performance, especially in endurance sports, in which the aerobic component is essential. According to an estimation of 2002, rhEPO doping was being used by 3-7% of the best athletes of endurance sports (Wilber, 2002). One of the main risks of abusive use of rhEPO gathers with the possible increase of the arterial pressure, which, together with the polycethemia (more red blood cells), potentate the probability of the incidence of cerebrovascular events or myocardial infarctions, that might be connected to the more common and outrageous phenomenon of sudden death in sport practice. In this context, we pretended, in this study, to evaluate the biochemical effects of rhEPO treatment at cardiovascular and metabolic level, as doping in Wistar rats under a chronic and aerobic training protocol (swimming) of moderate intensity. To do so, we have idealized an experimental protocol with the following study groups: Control group (Ctrl); rhEPO supplanted group (EPO); exercise group (Ex) and exercise with coadministration of rhEPO (Ex+EPO). It has been stipulated an experimental period of 10 weeks, after a prior interval of adaptation to the physical activity of 3 weeks. In the course of the study, we have opened horizons and established new protocols. Therefore, the specific objectives of this project were: 1º Study – Evaluate the effects of rhEPO in chronic exercise (training) A – Effects of rhEPO by itself (EPO group versus control group) B – Effects of rhEPO in rats under aerobic and chronic training (swimming) To fulfill that desire, we have consider the follow parameters: i - body weight; ii - arterial pressure, heart rate and tissue trophy; iii - hematological parameters: from erythrocytes, platelets, reticulocytes and leucocytes; iv - serum EPO concentration; v - iron metabolism, through the serum concentrations of iron, ferritin and transferrin; vi - biochemical parameters: glycaemia, renal and hepatic function, creatinine kinase concentration and lipid profile; vii - sympathetic nervous system (SNS) activity: by the concentration of catecholamines in circulation (in plasma and in platelets) and in peripheral tissue (adrenals, kidney, aorta and left ventricle) and brain; viii - serotoninergic system activity: via concentration of 5-HT and 5-HIAA in circulation (in plasma and in platelets) and in the neuronal tissue; ix- inflammation markers: serum concentrations of PCR, IL-2, IL-1β, TNF-α and TGF-β; x - oxidative equilibrium indicators: lipid peroxidation (MDA formation) in serum and muscle, serum 3- nitrotyrosine (3-NT) concentration, total antioxidant status (TAS) in serum and muscle and MDA/TAS relationship; xi - histomorphological study of some tissues. 2º Study – Effects of rhEPO in different forms of acute exercise (swimming versus running): through the analysis of almost all the above mentioned parameters, along with the information about the duration of the strenuous session. 3º Study – Effects of rhEPO in exercise (swimming), chronic versus acute: using the Ex and EPO+Ex groups of swimming above referred, we have designed comparative study between chronic and acute exercises. 4º Study – EPO serum concentration and haemogram variations along the timeline and depending of the rhEPO dosage: evaluation of the effects of the subcutaneous application of rhEPO in hematological and biochemical parameters, in EPO serum concentration and iron metabolism. The use of rhEPO, per se, for a 10 week period, in a 50 UI/kg/week dosage, has promoted an increase in blood pressure, heart rate and mass, originated hyperlipidaemia (mainly LDL-c and TGs), elevation of platelet and neuronal 5-HT content, developed, yet, elevation of inflammatory markers (TNF-α e TGF-β), increment in muscular oxidative stress, but antioxidant protection in circulation (raise in TAS and reduction in 3-NT). The rats under continued physical exercise and rhEPO treatment (for 10 weeks) have obtained an increase in the RBCs concentration, hemoglobin and haematocrit, that suggests a rise in blood viscosity, accompanied by arterial hypertension, sympathetic and serotonergic hyperactivation, oxidative stress (mostly muscular) and inflammation, consubstantiating a higher cardiovascular risk. The death of a rat belonging to the Ex+EPO group (most likely to a cardiac episode as we can forecast by the functional/structural modifications), in a eight animals universe administered with rhEPO (50 UI/kg/week), sets a probability superior than 10%, that represents a meaningful alert about the life dangers with the practice of continuous rhEPO doping in athletes. The acute session handled different effects according to the modality: the running practice launched, essentially, beneficial reductions of lipid profile (Total-c and LDL-c) and harmful increases of pro-oxidants markers, while swimming favored superior SNS activation. Prior administration of rhEPO (during 3 weeks) promoted: in acute physical exercise, higher physical resistance, hyperglicaemia, improvement of lipid profile and enlarged protection against oxidative stress. In swimming, activation of sympathetic and serotonergic systems was increased. The comparison between chronic training and acute exercise, in the groups under rhEPO treatment, allowed the perception of a much worsen effect in the rats under continued physical exercise (chronic training). Therefore, there was an increase in RBCs concentration, hemoglobin and haematocrit, suggesting a rise in blood viscosity which, alongside with the development of arterial hypertension, sympathetic and serotonergic hyperactivation, oxidative stress and inflammation, emphasizes the injurious cardiovascular risk. In contrast, the effect of rhEPO in the acute exercise privileged, mainly, platelet activation, increased glicaemia and strong serotonergic activation, without relevant changes in SNS and inflammation, even inducing a healthier oxidative profile. In conclusion, athletes under regular training and rhEPO doping are highly exposed to the cardiometabolic complications underlying the illegal use of this substance and present an elevated risk for a cardio/cerebrovascular event.