DSpace Collection:https://hdl.handle.net/10316/1362024-03-28T08:55:25Z2024-03-28T08:55:25ZComputational design and synthesis of molecules for application in antimicrobial therapiesAroso, Rafael Tiago Pereira Martinshttps://hdl.handle.net/10316/1017562022-09-12T20:41:52Z2022-07-20T00:00:00ZTitle: Computational design and synthesis of molecules for application in antimicrobial therapies
Authors: Aroso, Rafael Tiago Pereira Martins
Abstract: The work presented in this PhD thesis is focused on the development of alternative antimicrobial therapies and new molecules for the inactivation of Escherichia coli, whose infections by multi-drug resistant (MDR) strains are a major concern for healthcare systems. These studies include potentiation of ciprofloxacin’s antibacterial activity through the use of photodynamic inactivation (PDI) and the synthesis of potential E. coli DNA gyrase B inhibitors, guided by computer-aided drug design (CADD) tools.
In Chapter 1, a summary of the scientific challenges associated with infections by MDR microorganisms is given, with particular focus on E. coli, together with a brief overview on the prospects of CADD for the development of new antimicrobials. Then, a critical analysis of the state of the art on the biological role of the bacterial DNA gyrase and enzyme inhibitors is presented. Finally, a brief outline of PDI and its combination with antibiotics for the management of topical infections is presented.
The first part of Chapter 2 describes the optimization of synthetic methods, using sustainable alternative reaction activation technologies (microwave and ultrasound irradiation) for preparation of cationic photosensitizers (PS). Under the newly developed conditions, cationic imidazolyl phthalocyanines (IPc-Zn-Et4+, IPc-In-Et4+) and porphyrins (IP-H-Me2+, IP-H-Me4+, IP-Zn-Me4+) were obtained with yields up to 59%, 63%, 95%, 92% and 90%, respectively.
In the second part of Chapter 2, structure-activity studies using these cationic photosensitizers in the photoinactivation of E. coli through PDI and its combination with ciprofloxacin (dual phototherapy) were performed. The effects of the cationic macrocycle structure (i.e. porphyrin or phthalocyanine-based), number of positive charges, coordinating central metal and amphiphilicity were evaluated. Overall, in PDI monotherapy all photosensitizers were active against E. coli in the nM concentration range even using very low light doses (1.8 J/cm2). The best outcome was obtained with the tetra-cationic porphyrin family (IP-H-Me4+ and IP-Zn-Me4+) where 5 log CFU E. coli reduction was achieved, at 32 nM PS concentration and 1.8 J/cm2 light dose. Then, aiming to achieve a synergistic effect between the combination of PDI with ciprofloxacin (CIP) an optimization of dual phototherapy protocol was carried out. The best result of this therapy for E. coli inhibition was achieved when PDI using IP-H-Me4+ as photosensitizer at 16 nM concentration and 5.4 J/cm2 light dose was followed by CIP administration (0.004 mg/L). This is a remarkable result that potentiated CIP antimicrobial activity, requiring 64-fold less CIP concentration (reduction from 0.25 mg/L – monotherapy to 0.004 mg/L – dual phototherapy) to achieve full E. coli inhibition. The dual phototherapy studies proceeded with the transposition to in vivo studies, for the treatment of mice wounds infected with E. coli. The animal studies revealed that the combination therapy (PDI + CIP) was more efficient than each individual monotherapy (PDI or CIP) both in the inactivation of bacteria and improvement of wound healing.
Chapter 3 describes the use of CADD tools (i.e. pharmacophore modeling and molecular docking) for the discovery of potential new inhibitors of the E. coli’s DNA gyrase B subunit. Firstly, optimized pharmacophore models were constructed based on the structural and biological data of known inhibitors reported in literature. Their performance in discriminating between active and inactive compounds was assessed, revealing a > 90% true active hit rate and a < 10% false positive rate. The pharmacophore models were combined with molecular docking (ChemScore function from GOLD software) to screen the National Cancer Institute (NCI) database and the most six promising structures were selected for biological evaluation. In parallel, both CADD tools were used to screen a virtually designed set of new derivatives of 2-(2-aminophenyl)-5(6)-substituted-1H-benzimidazoles, which led to the selection of three promising molecules to pursue their chemical synthesis: 2-(2-aminophenyl)-5(6)-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-1H-benzimidazole (3.14), 2-(2-aminophenyl)-5(6)-(3-fluoro-4-(methoxycarbonyl)phenyl)-1H-benzimidazole (3.15), 2-(2-aminophenyl)-N-(3-(methylsulfonyl)phenyl)-1H-benzimidazol-5(6)-amine (3.16). The preparation of such compounds encompassed condensation of 4-bromo-1,2-diaminobenzene with 2-nitrobenzaldehyde to give the base scaffold 5(6)-bromo-2-(2-nitrophenyl)-1H-benzimidazole 3.1 with 62% yield in multi-gram scale. After benzimidazole NH protection, the 5(6) position was modulated through Pd-catalyzed coupling reactions, namely Suzuki-Miyaura (yields up to 72%) and Buchwald-Hartwig (yield up to 81%). Finally, Pd-catalyzed hydrogenation allowed to obtain the desired compounds 3.14 - 3.16 in yields up to 91%. Methylation of 3.11 in DMF gave the cationic 1,3-dimethyl-5(6)-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-2-(2-nitrophenyl)-1H-benzimidazol-3-ium iodide (3.17) in 96% yield. Both the synthesized molecules and the ones supplied by NCI were evaluated in DNA gyrase and E. coli inhibition, but no activity was detected with concentrations lower than 100 µM and 250 mg/L, respectively. Nevertheless, some compounds acquired from NCI (number 647083, NCI-4) and from the newly synthesized benzimidazole family (3.17) displayed appreciable Staphylococcus aureus antimicrobial activity, with minimum inhibitory concentration (MIC) values of 42 and 125 mg/L, respectively.
In Chapter 4, the experimental procedures and full compound characterization are presented.; O trabalho apresentado nesta tese de doutoramento é centrado no desenvolvimento de terapias antimicrobianas alternativas e novas moléculas para a inativação de Escherichia coli, cujas infeções por estirpes multirresistentes (MDR) são uma grande preocupação para os sistemas de saúde. Os estudos efetuados incluem a potenciação da atividade antibacteriana da ciprofloxacina através do uso da inativação fotodinâmica (PDI) e a síntese de potenciais inibidores da E. coli DNA girase, guiada por ferramentas de design de fármacos assistida por computador (CADD).
No Capítulo 1 encontra-se um resumo dos desafios científicos associados a infeções por microrganismos do tipo MDR, com um foco particular na E. coli, juntamente com uma visão geral sobre as perspetivas do CADD para o desenvolvimento de novos antibacterianos. De seguida, é apresentada uma análise crítica do estado da arte sobre o papel biológico da DNA girase bacteriana e seus inibidores. Finalmente, é apresentado um breve sumário da PDI e da sua combinação com antibióticos para aplicação no tratamento de infeções tópicas.
A primeira parte do Capítulo 2 descreve a otimização de métodos sintéticos através de tecnologias sustentáveis para a ativação de reações (irradiação de micro-ondas e ultrassons) para a preparação de fotossensibilizadores (PS) catiónicos. Sob as condições desenvolvidas, ftalocianinas (IPc-Zn-Et4+, IPc-In-Et4+) e porfirinas (IP-H-Me2+, IP-H-Me4+, IP-Zn-Me4+) do tipo imidazolil catiónicas foram obtidas com rendimentos até 59%, 63%, 95%, 92% e 90%, respetivamente.
Na segunda parte do Capítulo 2 são apresentados estudos de estrutura-atividade utilizando estes fotossensibilizadores catiónicos na fotoinativação da E. coli, utilizando PDI e a sua combinação com ciprofloxacina (fototerapia dual). Foi avaliado o efeito da estrutura do macrociclo (porfirina ou ftalocianina), número de cargas positivas, metal central e anfifilicidade. De um modo geral, todos fotossensibilizadores foram ativos na fotoinativação de E. coli em concentrações na ordem dos nM e usando doses de luz muito baixas (1.8 J/cm2). O melhor resultado foi obtido com a família de porfirinas tetra-catiónicas (IP-H-Me4+ e IP-Zn-Me4+), com a quais foi obtida uma redução em 5 log de unidades formadoras de colónias (UFC) de E. coli, utilizando 32 nM de PS e uma dose de luz de 1.8 J/cm2. Posteriormente, foi efetuada uma otimização do protocolo de fototerapia dual, tendo em vista alcançar um efeito sinérgico entre a combinação de PDI com ciprofloxacina (CIP). O melhor resultado em fototerapia dual para a inativação de E. coli foi alcançado usando IP-H-Me4+ como PS, numa concentração de 16 nM e dose de luz de 5.4 J/cm2, seguido da administração de CIP (0.004 mg/L). Este é um resultado notável, conduzindo à potenciação da atividade da CIP, sendo necessária uma concentração de CIP 64 vezes inferior (redução de 0.25 mg/L – monoterapia para 0.004 mg/L – fototerapia dual) para a inibição total de E. coli. Os estudos de fototerapia dual prosseguiram com a transposição para estudos in vivo, no tratamento de feridas de murganho infetadas com E. coli. Os estudos em animais evidenciaram a eficiência da fototerapia dual (PDI + CIP) quando comparado com as monoterapias individuais (PDI ou CIP), tanto na inativação de bactérias, como na melhoria da cicatrização das feridas.
O Capítulo 3 descreve o uso de ferramentas CADD (i.e. modelos de farmacóforo e docking molecular) para a descoberta de novos potenciais inibidores da subunidade B da E. coli DNA gyrase. Em primeiro, foram construídos modelos de farmacóforo otimizados, baseados em informações estruturais e biológicas de inibidores reportados na literatura. O seu desempenho em distinguir entre moléculas ativas e inativas foi avaliado, revelando uma taxa > 90% na identificação de ativos e < 10% de falsos positivos. Os modelos de farmacóforo foram combinados com docking (função de ChemScore do software GOLD) para filtrar a base de dados do National Cancer Institute (NCI) e as seis moléculas mais promissoras foram selecionadas para avaliação biológica. Em paralelo, as ferramentas de CADD foram utilizadas para filtrar uma base de dados de novos derivados de 2-(2-aminofenil)-5(6)-substituídos-1H-benzimidazoles desenhados virtualmente, levando assim à seleção de três moléculas promissoras para prosseguir com a sua síntese química: 2-(2-aminofenil)-5(6)-(3,4,5-trimetoxifenil)-1H-benzimidazole (3.14), 2-(2-aminofenil)-5(6)-(3-fluoro-4-(metoxicarbonil)fenil)-1H-benzimidazole (3.15), 2-(2-aminofenil)-N-(3-(metilsulfonil)fenil)-1H-benzimidazol-5(6)-amina (3.16). A preparação destes compostos envolveu a condensação do 4-bromo-1,2-diaminobenzeno com 2-nitrobenzaldeído, obtendo-se a molécula base 5(6)-bromo-2-(2-nitrofenil)-1H-benzimidazole 3.1 na escala de multi-grama, com 62% de rendimento. Após proteção do grupo NH do benzimidazole, a posição 5(6) foi modulada através de reações de acoplamento catalisadas por Pd, nomeadamente do tipo Suzuki-Miyaura (rendimentos até 72%) e Buchwald-Hartwig (rendimentos até 81%). Finalmente, os compostos idealizados 3.14 - 3.16 foram obtidos com rendimentos até 91%, mediante hidrogenação com Pd. A metilação de 3.11 em DMF permitiu obter o composto catiónico iodeto de 1,3-dimetil-5(6)-(3,4,5-trimetoxifenil)-2-(2-nitrofenil)-1H-benzimidazol-3-io (3.17) com 96% de rendimento. Tanto as moléculas sintetizadas como as fornecidas pelo NCI foram avaliadas na inibição da DNA girase e de E. coli, no entanto não foi observada atividade em concentrações abaixo de 100 µM e 250 mg/L, respetivamente. No entanto, alguns compostos do NCI (número 647083, NCI-4) e da nova família de benzimidazóis recém-sintetizados (3.17) demonstraram uma atividade antimicrobiana significativa contra Staphylococcus aureus, com valores de concentração mínima inibitória (CMI) de 42 e 125 mg/L, respetivamente.
No Capítulo 4, são apresentados os procedimentos experimentais e a caracterização completa dos compostos sintetizados.
Description: Tese de Doutoramento em Química, ramo de Química Médica, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.2022-07-20T00:00:00ZIsatin and Multicomponent Reactions: Sustainable Catalytic Synthesis of Novel Bioactive Oxindole DerivativesBrandão, Pedro Manuel da Costa Gomeshttps://hdl.handle.net/10316/1004172022-06-17T23:20:46Z2022-02-17T00:00:00ZTitle: Isatin and Multicomponent Reactions: Sustainable Catalytic Synthesis of Novel Bioactive Oxindole Derivatives
Authors: Brandão, Pedro Manuel da Costa Gomes
Abstract: The central goal of the work presented in this doctoral dissertation was to showcase multicomponent reactions and catalytic processes as sustainable tools for the efficient synthesis of structurally diverse libraries with potential biological activity and promising druglike properties. This approach is particularly valuable when privileged scaffolds are used as starting materials of the multicomponent reactions. Isatin and tryptanthrin are two related compounds, known for possessing great interest in the fields of medicinal chemistry and drug discovery and were selected as key components for library generation. Among the various multicomponent reactions described in the literature, the Ugi reaction is known for being widely applied in the synthesis of active pharmaceutical ingredients and other biologically active compounds. The interest on this reaction is motivated by its robustness, reliability, and for the ability to generate, in one single step, two new amide bonds, a functional group known to be present in several pharmacologically active compounds. The Ugi four component reaction, its most classic version, was applied for the synthesis of new oxindole derivatives bearing two linear amides (Library I). Thorough optimization of the synthetic methodology enabled us to select the Lewis acid indium (III) trichloride as a safe, easy to use, cheap, and green catalyst. This approach, the first to be reported on an isatin-based Ugi four component reaction, was suitable for a wide range of substrate scope, allowing the preparation of new compounds with considerable structural diversity. Limitations for the methodology were also identified, such as the relevance of the carboxylic acid component pKa for reaction selectivity. Library I was evaluated in vitro against several tumor cell lines, with promising results, including low and sub-micromolar range of antiproliferative activity. In silico druglikeness evaluation of this library also validated the potential of this molecules as drug candidates. Using another version of the Ugi reaction, the Ugi four-center three component reaction, a molecular hybridization approach was considered for the synthesis of a library of oxindole-lactam hybrids (Library II). Using isatin as starting material, a series of oxindole-lactam hybrids was obtained, aiming to inhibit cholinesterases, relevant therapeutic targets in Alzheimer’s disease. The resulting library proved to be selective inhibitors of butyrylcholinesterase, with three compounds presenting inhibition values below 10 micromolar. The druglikeness evaluation of Library II in silico indicate the ability of two of these most active compounds to cross the blood-brain barrier by passive diffusion, and therefore might be an excellent point for the development of selective butyrylcholinesterase inhibitors, a therapeutic option so far unavailable in clinical practice. This catalyst-free approach proved to be suitable for a wide range of substrates and therefore enabled great structural diversity. The serendipity discovery of a new synthetic methodology to prepare the valuable alkaloid tryptanthrin from isatin and indigo, using I2/NaH/DMF as oxidant trio, is also reported. This approach, promoted under microwave irradiation, proved to be time-efficient and a green alternative for the synthesis of tryptanthrin. Next, we decided to engage this tetracyclic bioactive compound in multicomponent reactions, a poorly explored research field. Our first efforts focused on the Ugi reaction, however all the attempts performed were unsuccessful. Computational studies were performed in order to understand the reactivity differences between isatin and tryptanthrin. Indeed, in the first step of the Ugi reaction (imine formation), the process is favored when using isatin, whereas the energetic barrier is higher when tryptanthrin is applied as starting material. Then, the Petasis multicomponent reaction was selected as model reaction, in order to further explore the reactivity of this molecule (namely, its aryl bromide derivatives). The tryptanthrin derivatives (Library III) were successfully prepared using BINOL as organocatalyst, and an asymmetric version using (R)-BINOL lead to excellent enantioselectivity. The Petasis adducts were then evaluated for their antimicrobial activity, and one compound exhibited moderate fungicidal activity, selective against dermatophyte fungal strains. The outputs of the work presented in this doctoral dissertation corroborate the impact of multicomponent reactions in the field of sustainable drug discovery and medicinal chemistry, especially when privileged scaffolds are employed. Several bioactive compounds were identified, targeting pathologies with great public health and socio-economic impact, such as cancer, neurodegenerative diseases and infectious diseases.; O principal objetivo do trabalho apresentado nesta dissertação de doutoramento visa demonstrar a relevância das reações multicomponente e de processos catalíticos enquanto ferramentas para a síntese sustentável de bibliotecas de compostos com diversidade estrutural, com potencial atividade biológica e propriedades druglike promissoras. Esta abordagem é particularmente relevante quando estruturas privilegiadas são usadas como materiais de partida das reações multicomponente. A isatina e a triptantrina são dois compostos conhecidos por terem um grande interesse para as áreas da química medicinal e de descoberta de fármacos, e foram por isso selecionadas como componentes-chave para a preparação de bibliotecas de compostos. Entre as várias reações multicomponente descritas na literature, a reação de Ugi é conhecida por ser abundantemente utilizada na síntese de substâncias ativas e de outros compostos com atividade biológica. O interesse nesta reação é amplamente motivado pela sua robustez, segurança e pela sua capacidade de gerar, num só passo reacional, duas novas ligações amida, um grupo funcional amplamente presente em compostos com atividade farmacológica. A reação de Ugi quatro componentes, a versão mais clássica desta reação, foi usada para a síntese de derivados oxindólicos com amidas lineares (biblioteca I). Uma otimização cuidada da metodologia de síntese levou-nos a selecionar o ácido de Lewis tricloreto de índio (III) enquanto catalisador seguro, fácil de utilizar, barato e amigo do ambiente. Esta abordagem, que constitui o primeiro exemplo de reação de Ugi quatro componentes usando isatina como material e partida, permitiu a utilização de vários substratos para a síntese de novos compostos, com elevado grau de diversidade estrutural. Limitações a esta metodologia também foram identificadas, nomeadamente no que diz respeito aos requisitos do pKa do ácido carboxílico para que a reação seja seletiva. A biblioteca I foi avaliada in vitro contra várias linhas celulares tumorais, com resultados promissores, incluindo atividade antiproliferativa em concentrações sub-micromolares. Avaliação in silico das propriedades de druglikeness da biblioteca também validam o seu potencial enquanto candidatos a fármacos. Usando uma outra versão da reação de Ugi, a reação de Ugi de quatro-centros três componentes, uma abordagem de hibridização molecular foi aplicada para a síntese de uma biblioteca de híbridos oxindole-lactama (biblioteca II). Através da utilização de isatina enquanto material de partida, vários híbridos oxindole-lactâmas foram obtidos, com o objetivo de inibir colinesterases, importantes alvos terapêuticos para a doença de Alzheimer. Os híbridos demonstraram possuir capacidade de inibição seletiva da butirilcolinesterase, com três dos compostos a apresentar atividade menor que 10 micromolar. A avaliação in silico das propriedades druglike demonstraram que dois dos três compostos mais ativos apresentam potencial para atravessar a barreira hematoencefálica por difusão passiva, e por estes motivos podem ser um excelente ponto de partida para o desenvolvimento de novos inibidores seletivos da butirilcolinesterase, uma opção terapêutica ainda não disponível na prática clínica. A metodologia sintética, que ocorre na ausência de catalisador, demonstrou ser suscetível de ser aplicada a um vasto número de reagentes e, assim, permitir uma grande diversidade estrutural. A descoberta por serendipismo de uma nova rota sintética para a obtenção do alcaloide triptantrina a partir de isatina ou indigo, usando I2/NaH/DMF como trio oxidativo, é também aqui descrita. Este processo, promovido por radiação micro-ondas, demonstrou permitir poupanças em tempo de reação e constituir uma alternativa sustentável para a síntese de triptantrina. De seguida, decidimos utilizar este composto tetracíclico, que apresenta várias atividades biológicas, em reações multicomponente, uma vez que esta área de investigação se encontra subexplorada. Os nossos primeiros esforços foram focados na reação de Ugi, mas sem sucesso. Estudos computacionais permitiram perceber as diferenças de reatividade entre isatina e triptantrina, demonstrando que o primeiro passo reacional da reação de Ugi (formação da imina) é favorecido com a isatina, enquanto que uma maior barreira energética é descrita quando triptantrina é usada como material de partida. Assim, selecionamos a reação de Petasis para novos estudos, de modo a explorar a reatividade desta molécula de novas formas. A biblioteca de derivados da triptantrina (biblioteca III) foi sintetizada utilizando BINOL como organocatalisador, e uma versão assimétrica com recurso ao (R)-BINOL foi também desenvolvida com sucesso, apresentando excelente enantiosseletividade. Os produtos da reação de Petasis foram avaliados quanto à sua atividade antimicrobiana, sendo que um dos novos derivados possuí atividade fungicida moderada, seletiva contra dermatófitos. Os resultados obtidos nesta dissertação de doutoramento permitem corroborar a importância das reações multicomponente na área da descoberta sustentável de novos fármacos e da química medicinal, em particular quando têm por base estruturas privilegiadas. Foram identificados vários novos compostos com atividade biológica, visando patologias com grande impacto socioeconómico e na saúde pública, como o cancro, as doenças neurodegenerativas e as doenças infeciosas.
Description: Tese de Doutoramento em Química apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.2022-02-17T00:00:00ZPhotoacoustic waves for Transdermal drug DeliverySá, Gonçalo Fernando Ferreira dehttps://hdl.handle.net/10316/999882022-04-27T22:16:03Z2012-01-01T00:00:00ZTitle: Photoacoustic waves for Transdermal drug Delivery
Authors: Sá, Gonçalo Fernando Ferreira de
Abstract: A pele funciona como barreira protectora contra a difusão de fármacos e patógenos, o
que delimita a administração transdérmica a um conjunto reduzido de moléculas. A
aplicação de metodologias passivas e activas, tal como, formulações tópicas,
promotores de absorção, patches transdérmicos e métodos físicos não constituem
ainda opções clinicamente válidas, para a larga maioria dos medicamentos, à
utilização de agulhas hipodérmicas, pelo que estas permanecem a principal alternativa
à entrega oral de fármacos, independentemente das questões relacionadas com a dor,
contaminações e reciclagem. A maioria destes sistemas transdérmicos não cumpre as
necessidades de segurança, eficácia e de dor requerente na administração transdérmica
de fármacos. A utilização de ondas fotoacústicas enquanto sistema transdérmico
consiste na conversão rápida e eficiente da energia de um pulso de laser, numa onda
de pressão intensa e de larga banda de frequências, capaz de transientemente
permeabilizar as camadas exteriores da pele ou da membrana celular. As ondas
fotoacústicas apresentam as seguintes características físicas: curta duração (cerca de
1000 vezes mais curto do que um microssegundo), banda de frequências até 200 MHz
e amplitude máxima de dezenas de atmosferas. A geração destas ondas assenta na
utilização de pulsos de laser curtos (< 8 ns), fluências de laser moderadas (< 50
mJ/cm2), de modo a gerar ondas com rápidos tempos de crescimento (> 1 bar/ns) e
pressões máximas até 50 bar, o que as coloca nos limites mínimos de perturbação
efectiva de barreiras biológicas (de 1 a 50 bar/ns). A eficiência da transdução da luz
laser em pressão pode ser conseguida através de um material de espessura reduzida,
com um coeficiente de Grüneisen elevado e pela incorporação de um corante, tal
como uma molécula com as propriedades das referências fotoacústicas, que respeite as
seguintes relações: i) uma absorção linear, ua, superior a 100 cm-1, e ii) um decaimento
não-radiativo para o estado fundamental inferior a <1 ns. A interacção das ondas
fotoacústicas com tecidos biológicos aumenta a perda de água transepidérmica
(TEWL), por um factor de 3, em pele humana, de forma indolor e reversível (2
minutos). A utilização destas ondas na administração transdérmica de fármacos
emprega ondas de 12 bar, com frequências de 100 MHz, pelo que o seu mecanismo de
interacção com os tecidos baseia-se na força acústica da radiação. Em particular, estas
ondas produzem gradientes de pressão superiores a 15 bar, através de 5 corneócitos da
pele (cada corneócito apresenta 5 μm de largura). A sonoforese e ultra-sonografia
(com frequências entre de 0,2-20 MHz) não interagem com os tecidos por este
mecanismo, uma vez que geram gradientes de pressão diminutos, se compararmos
com a largura da camada córnea da pele (comprimento de onda típico de um ultra-som
de 1 MHz é de é de 150 μm, enquanto que a espessura do estrato córneo é de 15 μm). Os resultados experimentais de entrega transdérmica com ondas fotoacústicas
mostram que a pele de minipigs permanece intacta após a entrega intra-epidérmica de
fotossensibilizadores (> 1000 Da) e de uma proteína de elevada massa molecular
(proteína de fluorescência verde, GFP de 27000 Da). A interacção das ondas
fotoacústicas com a membrana celular e a concomitante expressão de GFP demonstra
o potencial desta técnica na permeabilização de membranas biológicas.; The remarkable protection against drugs and pathogens provided by the skin limits
transdermal delivery to a very small set of the medicines. Topical formulations,
absorption enhancers, transdermal patches and physical methods with therapeutic
purposes have added more to popular folklore than to the clinical armamentarium, and
hypodermic needles remain the most relevant alternative to oral delivery regardless of
pain, contaminations and waste/recycling. These alternative transdermal systems have
not yet fulfilled the need for safe, painless, efficient and affordable transdermal
delivery of drugs. The photoacoustic waves (PA) transdermal system consists in the
rapid and efficient conversion of the energy of a laser pulse into a broadband and
intense pressure wave capable of transiently permeabilizing the outer layers of the
skin or of the cellular membrane. Each photoacoustic wave is of very short duration
(almost 1000 times shorter than a microsecond), covers a broad band of frequencies
(up to 200 MHz), and its maximum amplitude is of tens of atmospheres. Short laser
pulses (< 8 ns) with modest laser fluences (< 50 mJ/cm2) can generate PA waves with
very high rise times (> 1 bar/ns) and moderate peak pressures (< 50 bar), within the
limits required to perturb biological barriers (1-50 bar/ns). Efficient light-to-pressure
transduction can be achieved with a thin material with a large Grüneisen coefficient
and by incorporating a dye, such as a molecule with the properties of photoacoustic
references, that respect the following relations: i) μa > 100 cm–1 at the incident laser
light, ii) ultrafast radiationless decays to the ground state (< 1 ns). Such PA waves
increase the transepidermal water loss (TEWL) by a factor of 3 in human skin in a
painless and reversible manner (2 minutes). The enhancement of drug delivery
employed 12 bar of photoacoustic waves and center frequencies of 100 MHz and
follows the acoustic radiation force mechanism. Indeed, we produced a 12 bar
pressure gradients across 5 skin corneocytes (approx. 5 μm wide). Sonophoresis and
ultrasonography (with center frequencies of 0.2-20 MHz) cannot operate through this
mechanism because they generate small pressure gradients across the stratum corneum
(the typical wavelength of ultrasound at 1 MHz is 150 μm whereas the thickness of
the stratum corneum is 15 μm). We also show that the skin of minipigs remains intact
after intraepidermal delivery of photosensitizers (> 1000 Da) and a large protein
(Green Fluorescence Protein, GFP of 27000 Da) with this method. The photoacoustic
waves interaction with the cellular membrane and the concomitant GFP expression
demonstrates this technique potential to effectively permeabilize biological barriers.
Description: Tese de Doutoramento em Química, na especialidade de Química Médica, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.2012-01-01T00:00:00ZNovas espiro-β-lactamas com potente dupla atividade antimicrobianaAlves, Nuno Alexandre Guerreirohttps://hdl.handle.net/10316/987392023-07-12T08:16:52Z2021-10-18T00:00:00ZTitle: Novas espiro-β-lactamas com potente dupla atividade antimicrobiana
Authors: Alves, Nuno Alexandre Guerreiro
Abstract: O trabalho apresentado nesta tese de Doutoramento teve como principal objetivo a descoberta de novos espiropenicilanatos quirais com atividade antimicrobiana contra o vírus do HIV e Plasmodium, o parasita da malária. Este propósito foi alcançado através de uma estratégia com uma forte componente de modelação estrutural racional de um conjunto de espiro-β-lactamas previamente identificados como tendo uma potente bioatividade contra ambos os agentes patógenos. Este trabalho foi desenvolvido no seguimento de um estudo prévio de bioatividade de uma biblioteca de espiro-β-lactamas que permitiu a identificação de uma espiro-3H-pirazole-β-lactama BSS-593 e duas espirociclopentenil-β-lactamas análogas BSS-730A e BSS-722A, com uma promissora dupla atividade contra HIV e Plasmodium. A molécula BSS-730A revelou-se como a mais promissora da série, demonstrando uma notável atividade submicromolar contra várias estirpes do vírus HIV-1 e HIV-2, incluindo estirpes multirresistentes, e contra as fases hepática e sanguínea da infeção por Plasmodium. A identificação destas espiro-β-lactamas constituiu o ponto de partida para o presente projeto de Doutoramento, servindo estas como moléculas lead no design de novos espiropenicilanatos quirais potencialmente bioativos. A estes resultados altamente promissores sucederam-se um conjunto de estudos visando a descrição e interpretação do mecanismo de ação da molécula BSS-730A. Apesar de não ter sido possível identificar o alvo molecular da espirociclopentenil-β-lactama BSS-730A, os resultados obtidos indicam que esta exerce a sua atividade antiviral por um mecanismo complexo e diferente do mecanismo associado aos fármacos anti-HIV atualmente disponíveis no mercado. As modelações estruturais em torno da espiro-3H-pirazole-β-lactama identificada como tendo atividade contra HIV e Plasmodium, focaram-se no seu anel β-lactama, nos grupos substituintes do anel 3H-pirazole e no grupo ácido carboxílico do núcleo penicilanato. Neste contexto, foram utilizadas abordagens sintéticas variadas, nomeadamente a cicloadição 1,3-dipolar entre diazo-lactamas e alquinos deficientes em eletrões, desproteção seletiva de ésteres benzidrilos e conversão de ácidos carboxílicos a ésteres e ácidos hidroxâmicos. No caso específico da modelação do anel β-lactama, foi desenvolvida uma nova via sintética que resultou na síntese de novo de um núcleo estrutural γ-lactâmico bicíclico análogo da penicilina, a partir do aminóacido natural D-penicilamina. Esta estratégia sintética permitiu a síntese de um conjunto de derivados γ-lactâmicos, análogos da espiro-3H-pirazole-β-lactama bioativa. As novas moléculas sintetizadas pela modelação estrutural da espiro-β-lactama BSS-593 foram testadas para a sua atividade in vitro contra o vírus do HIV-1, permitindo a recolha de informações valiosas acerca da relação estrutura-atividade desta classe de espiro-β-lactamas, assim como sobre o seu potencial mecanismo de ação. Relativamente à classe das espirociclopentenil-β-lactamas, adotou-se uma estratégia de modelação estrutural preliminar em volta de diversos grupos substituintes da espirociclopentenil-β-lactama BSS-730A, assente em estratégias como a desproteção seletiva de ésteres benzidrilos e a cicloadição [3+2] formal entre 6-alquilidenopenicilanatos e 2-butinoatos ou alenoatos. Esta abordagem permitiu a identificação do éster benzilo da posição 2’ do anel ciclopenteno da espirociclopentenil-β-lactama BSS-730A como sendo suscetível a modelações estruturais, sem que estas comprometam significativamente a atividade antiviral e anti-Plasmodium dos derivados. A modelação de tal posição pela substituição do respetivo éster benzilo por pequenos ésteres alquílicos, nomeadamente um éster metílico e etílico, resultou na síntese de dois compostos com atividade nanomolar contra o HIV-1, e atividade micromolar contra Plasmodium berghei e Plasmodium falciparum. Adicionalmente, foi ainda possível identificar algumas características estruturais críticas para a atividade da classe das espirociclopentenil-β-lactamas. A identificação de dois novos compostos bioativos, obtidos através da modelação da posição 2’ do anel espirociclopenteno da espiro-β-lactama lead, serviu de base racional e impulsionadora a uma nova ronda de modelações estruturais focadas exclusivamente naquela posição, visando dotá-la com outros grupos éster variados, como são exemplo ésteres arílicos, ésteres alquílicos de cadeia longa ou ésteres benzílicos substituídos. Com este objetivo foi utilizada uma estratégia sintética exclusivamente baseada na cicloadição [3+2] formal entre um 6-alquilidenopenicilanato e diferentes alenoatos monossubstituídos. As novas espirociclopentenil-β-lactamas tiveram a sua atividade in vitro anti-HIV-1 determinada, o que resultou na identificação de seis moléculas adicionais com uma atividade antiviral nanomolar, de entre as quais duas demonstraram um notável valor de IC50 inferior a 20 nM. Por fim, foram estabelecidos dois protocolos computacionais diferentes, baseados em pesquisas de similaridade contra compostos bioativos de alvo molecular conhecido, com o intuito de recolher informações acerca do alvo molecular putativo da classe das espirociclopentenil-β-lactamas bioativas desenvolvidas ao longo deste trabalho. Este procedimento implicou a construção de uma base de dados interna contendo a estrutura e dados de bioatividade de cerca de 283 mil compostos com alvo molecular conhecido. Em suma, os estudos desenvolvidos no decurso desta tese de Doutoramento conduziram à síntese de uma biblioteca extensa de novas espiro-β-lactamas quirais, de entre as quais foi possível identificar um conjunto relevante de moléculas com uma notável atividade nanomolar contra o vírus do HIV-1. De entre as moléculas com atividade antiviral, todas aquelas cuja atividade anti-Plasmodium foi avaliada demonstraram também atividade contra o parasita. Este comportamento é concordante com o anteriormente observado para as moléculas lead, e é indicativo de que esta atividade antimicrobiana dupla possa ser transversal a todos os restantes espiropenicilanatos identificados como bioativos contra o vírus do HIV. Esta abordagem resultou ainda na recolha de uma elevada quantidade de informação que permitiu uma interpretação qualitativa extensa e compreensiva da relação de estrutura-atividade das classes de espiro-β-lactamas exploradas ao longo deste trabalho. Em termos de resultados relativos ao mecanismo de ação antiviral, focados na molécula lead ativa representativa da classe das espirociclopentenil-β-lactamas, associados à dupla atividade antimicrobiana observada, constituem uma indicação de que estas moléculas possam atuar ao nível do hospedeiro e, consequentemente, poderão demonstrar atividade contra outros agentes patógenos para além dos já explorados. No cômputo geral, os notáveis resultados de bioatividade e mecanismo de ação apresentados ao longo desta tese de Doutoramento, traduzem-se numa afirmação inequívoca do potencial farmacoterapêutico da classe das espiro-β-lactamas no panorama da saúde pública atual, justificando a aposta no seu desenvolvimento como uma possível alternativa às terapias antivirais e anti-malária atualmente disponíveis.; The main goal of this PhD thesis was the discovery of new chiral spiropenicillanates with antimicrobial activity against HIV and Plasmodium. This purpose was achieved through a strategy relying on rational structural modulation of a set of spiro-β-lactams previously identified as highly potent against the two pathogens. The present work was developed following a prior bioactivity study focused on a library of spiro-β-lactams which allowed the identification of a spiro-3H-pyrazol-β-lactam BSS-593 and two spirocyclopentenil-β-lactams BSS-730A and BSS-722A, displaying a promising dual activity against both HIV and Plasmodium. The most promising molecule, BSS-730A, presented a remarkable submicromolar activity against multiple strains of HIV-1 and HIV-2, including multidrug resistant strains, and against both hepatic and erythrocytic stages of Plasmodium infection. The identification of these spiro-β-lactams was the starting point for this PhD thesis, as these served as lead molecules for the rational design of new chiral spiro-β-lactams potentially bioactive. These highly promising preliminary results were followed by studies focused on determining the mechanism of action of the most promising molecule BSS-730A. Although it was not possible to identify its molecular target, the results suggest that spiro-β-lactam BSS-730A exerts its antiviral activity though a complex mechanism, different from those of the currently approved anti-HIV drugs. Spiro-3H-β-lactam BSS-593, active against HIV and Plasmodium, was target of structural modulations on its β-lactam ring, 3H-pyrazol ring substituents and carboxylic acid moiety. This approach comprised synthetic strategies such as 1,3-dipolar cycloaddition between diazo-lactams and electron-deficient alkynes, selective deprotection of benzhydryl esters and carboxylic acid conversion to an ester or an hydroxamic acid. Concerning the structural modulation of the β-lactam ring, an unprecedent synthetic route was developed, resulting in the de novo synthesis of a penicillin analogue γ-lactam bicyclic structural core, from the natural amino acid D-penicillamine. The previous synthetic approach allowed the synthesis of spiro-3H-pyrazol-γ-lactams analogues of BSS-593. All the new molecules synthesized through structural modulation of spiro-β-lactam BSS-593 were assayed for their in vitro activity against HIV-1, allowing the gathering of relevant information about the spiro-3H-pyrazol-β-lactams’ structure-activity relationship and mechanism of action. Concerning the synthesis of new spirocyclopentenyl-β-lactams, a preliminary structural modulation strategy was performed using BSS-730A as lead molecule. This strategy included synthetic approaches such as selective deprotection of benzhydryl esters and [3+2] annulation of 6-alkylidenepenicilanates with allenes or 2-butynoates. The benzyl ester present on position 2’ of BSS-730A’s cyclopentenene ring was identified as susceptible to structural modulations, since structural changes on this functional group did not significantly compromise the obtained derivatives’ bioactivity. In fact, the replacement of the benzyl ester with small alkyl esters, namely a methyl and an ethyl ester, afforded two new spirocyclopentenil-β-lactams with nanomolar activity against HIV-1 and micromolar activity against Plasmodium berghei and Plasmodium falciparum. Moreover, the later structural modulation strategy allowed the identification of some structural features which are critical for BSS-730A antiviral activity. These promising results led to a new round of structural modulations exclusively focused on position 2’ of BSS-730A’s cyclopentenyl ring, namely by endowing this position with different classes of esters, like aryl esters, long chain alkyl esters or substituted benzyl esters as the main examples. The new spirocyclopentenil-β-lactams were synthesized via [3+2] annulation of a 6-alkylidenepenicilanate with a set of different monosubstituted allenes. The new BSS-730A’s analogues were assayed for their in vitro anti-HIV-1 activity, being identified six additional molecules with nanomolar activity against HIV-1, among which two showed a remarkable IC50 value lower than 20 nM. Finally, two different computational approaches relying on similarity search were employed with the purpose of gathering information regarding the bioactive spiro-β-lactams putative molecular target. The former approach required the building of an internal database containing structural and bioactivity data of around 283 thousand bioactive compounds with known molecular target. In summary, the work developed during this PhD thesis led to the synthesis of an extensive library of new chiral spiro-β-lactams, among which was identified a set of molecules with a potent in vitro activity against HIV-1. Two of the spiro-β-lactams which displayed antiviral activity were tested for their antiplasmodial activity, proving to also inhibit both the parasite’s hepatic and blood infectious stage. Such behaviour agrees with the bioactivity profile observed for the lead molecules, suggesting that this dual antimicrobial activity may be transversal to all the identified bioactive spiro-β-lactams. Moreover, this approach allowed an extensive and comprehensive qualitative analysis and interpretation concerning the structure-activity relationship of the spiro-3H-pyrazol-β-lactams and spirocyclopentenil-β-lactams explored during this work. Studies focused on unveiling the lead molecule BSS-730A’s mechanism of action combined with the observed dual antimicrobial activity suggest that the bioactive spiro-β-lactams may display activity against other pathogens, apart from those already explored. Overall, the studies and respective results reported herein support the claim that the spiro-β-lactam’s class present a remarkable pharmacotherapeutic potential, justifying its further development as a possible alternative to currently available antiviral and antiplasmodial therapies.
Description: Tese de Doutoramento em Química, ramo de Química Médica, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.2021-10-18T00:00:00Z